A diferenciação de células-tronco em ilhotas fornece uma solução alternativa ao tratamento convencional do diabetes e à modelagem da doença. Descrevemos um protocolo detalhado de cultura de células-tronco que combina um kit de diferenciação comercial com um método previamente validado para auxiliar na produção de ilhotas derivadas de células-tronco secretoras de insulina em um prato.
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Artigo de método
Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em células beta secretoras de insulina fornece material para investigar a função das células beta e o tratamento do diabetes. No entanto, permanecem desafios na obtenção de células beta derivadas de células-tronco que mimetizem adequadamente as células beta humanas nativas. Com base em estudos anteriores, células de ilhotas derivadas de hPSC foram geradas para criar um protocolo com melhores resultados de diferenciação e consistência. O protocolo aqui descrito utiliza um kit progenitor pancreático durante os estágios 1-4, seguido por um protocolo modificado de um artigo publicado anteriormente em 2014 (doravante denominado "protocolo R") durante os estágios 5-7. Procedimentos detalhados para o uso do kit de progenitores pancreáticos e placas de micropoços de 400 μm de diâmetro para gerar clusters de progenitores pancreáticos, protocolo R para diferenciação endócrina em um formato de suspensão estática de 96 poços e caracterização in vitro e avaliação funcional de ilhotas derivadas de hPSC são incluídos. O protocolo completo leva 1 semana para a expansão inicial da hPSC seguida por ~5 semanas para obter ilhotas hPSC produtoras de insulina. Pessoal com técnicas básicas de cultura de células-tronco e treinamento em ensaios biológicos pode reproduzir esse protocolo.
Introdução
As células beta pancreáticas secretam insulina respondendo a aumentos nos níveis de glicose no sangue. Pacientes sem produção suficiente de insulina devido à destruição autoimune das células beta no diabetes tipo 1 (DM1)1, ou devido à disfunção das células beta no diabetes tipo 2 (DM2)2, são tipicamente tratados com a administração de insulina exógena. Apesar dessa terapia que salva vidas, ela não pode corresponder precisamente ao controle requintado da glicose no sangue, como alcançado pela secreção dinâmica de insulina das células beta de boa-fé. Como tal, os pacientes frequentemente sofrem as consequências de episódio....
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Protocolo
Este protocolo é baseado no trabalho com linhagens hPSC, incluindo H1, HUES4 PDXeG e Mel1 INSGFP/W, em condições livres de alimentadores. Um procedimento passo a passo é detalhado nesta seção, com dados de apoio da diferenciação de Mel1 INSGFP/W na seção de resultados representativos. Recomendamos que seja necessária uma otimização adicional ao trabalhar com outras linhas hPSC que não são indicadas aqui. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os reagentes e soluções usados neste protocolo.
1. Preparação de meios e soluções de diferenciação
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Resultados
Desenvolvemos uma estratégia híbrida para diferenciar células-tronco em ilhotas hPSC secretoras de insulina em sete etapas, que utiliza um kit de progenitores pancreáticos para os quatro primeiros estágios em cultura plana, seguido por um protocolo modificado baseado em um método previamente relatado6 em uma cultura de suspensão estática para os últimos três estágios (Figura 1). Com esse protocolo, garantir uma cultura de quase confluência (90%-100%) em 24 h após a se.......
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Discussão
Este trabalho descreve um protocolo híbrido de sete estágios que permite a geração de ilhotas hPSC capazes de secretar insulina após desafio glicêmico dentro de 40 dias de cultura in vitro. Dentre essas múltiplas etapas, acredita-se que a indução eficiente da endoderme definitiva seja um importante ponto de partida para os resultados finais dediferenciação18,27,28. No protocolo do fabricante, uma densidade de semeadura .......
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Divulgações
Timothy J. Kieffer foi um funcionário da ViaCyte durante a preparação deste manuscrito. Os demais autores declaram não haver interesses conflitantes.
Agradecimentos
Agradecemos o apoio da STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. Jia Zhao e Shenghui Liang recebem o Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam recebeu a Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima recebeu a Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship e o CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Agradecemos sinceramente ao Dr. Edouard G. Stanley da MCRI e da Monash University por compartilhar a linha Mel1 INS GFP/W e o Alberta Diabetes Institute Islet Core por isolar e distribuir ilhotas humanas. Também agradecemos o apoio....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 3,3',5-Triiodo-L-tireonina (T3) | Sigma | T6397 | Solução de hormônio tireoidiano |
| 4% PFA | Cruz Biotechnology | sc-281692 | Deve ser manuseado em capela |
| de exaustão 96-Well, Ultralow Attachment, fundo plano | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Fundo plano; para cultura de suspensão estática nos últimos três estágios |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Reagente de dissociação para células de estágio 4 |
| Placas Aggrewell400 | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µ placas de micropoços de diâmetro |
| m Placas Aggrewell800 | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µ placas de micropoços de diâmetro m |
| Alexa Fluor 488 Cabra anti-FOXA2 (cabra IgG) | R& D Systems | IC2400G | 1:100 em citometria de fluxo; usado para testar células de estágio 1 |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R & D Systems | IC108G | 1:100 em citometria de fluxo |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (camundongo IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 em citometria de fluxo; usado para testar células do estágio 7 |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R& D Systems | IC0041G | 1:500 em citometria de fluxo |
| Alexa Fluor 647 Camundongo anti-peptídeo C humano (camundongo IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2.000 em citometria de fluxo; usado para testar células de estágio 7 |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (camundongo IgG1 e kappa;) | BD Sciences | 565689 | 1:2.000 em citometria de fluxo |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (camundongo IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 em citometria de fluxo; usado para testar células de estágio 4 |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (camundongo IgG1 e kappa;) | BD Sciences | 562594 | 1:50 em citometria de fluxo; usado para testar células de estágio 1 |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Controle de Isotipo | BD Sciences | 557714 | 1:50 in citometria de fluxo |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta inibidor de sinalização |
| Anti-Aderência Solução de Enxágue | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | Para GSIS estático e fins de imagem confocal |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | Para procedimento de imunocoloração |
| CK19 anticorpo | DAKO | M0888 | 1:50 em imunofluorescência de montagem inteira |
| D-glicose | Sigma | G8769 | Suplemento médio |
| DAPI | Sigma | D9542 | Para contracoloração nuclear |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Solução de diluição de matriz |
| Burro anti-cabra Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 em toda a montagem imunofluorescência |
| Burro anti-cabra Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 em imunofluorescência de montagem total |
| Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 em imunofluorescência de montagem total |
| Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 em imunofluorescência de montagem total |
| Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 em imunofluorescência de montagem completa |
| Burro anti-coelho Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 em imunofluorescência de montagem completa |
| Burro anti-ovelhas Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 em imunofluorescência de montagem completa |
| DPBS | Sigma | D8537 | Sem Ca2+ e Mg2+ |
| ELISA, insulina, | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | Para medição de insulina humana |
| BSA | Proliant | 68700 | sem |
| de solução de fixação e permeabilização | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm e 10x Perm/Wash incluídas |
| Reagente de dissociação celular suave | STEMCELL Technologies | 7174 | Para hPSCs de passagem de aglomerados durante a cultura de manutenção |
| Anticorpo de glucagon | Sigma | G2654 | 1:400 em imunofluorescência de montagem total |
| GLUT1 anticorpo Thermo | Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 em imunofluorescência de montagem total |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | suplemento de L-glutamina |
| Glicerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | Para limpeza e montagem de tecidos |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Inibidor de entalhe |
| Heparina | Sigma | H3149 | Suplemento médio |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulina-Transferrina-Selênio-Etanolamina; suplemento médio |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonista |
| MAFA anticorpo | Abcam | ab26405 | 1:200 in Matriz de imunofluorescência de montagem completa |
| , qualificada por hESC | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Matriz extracelular para revestimento de superfície de vasos |
| MCDB131 médio | Life technologies | 10372019 | Base |
| medium mTeSR1 Kit Completo | STEMCELL Tecnologias | 85850 | meio de células-tronco e suplemento 5x incluído |
| N-Cys (N-acetilcisteína) | Sigma | A9165 | Antioxidante |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Suplemento médio |
| NEUROD1 anticorpo | R& D Systems | AF2746 | 1:20 em imunofluorescência de montagem total |
| NKX6.1 anticorpo | DSHB | F55A12-c | 1:50 em imunofluorescência de montagem completa |
| Anticorpo polipeptídico pancreático | R& D Systems | AF6297 | 1:200 em imunofluorescência de montagem completa |
| PBS | Sigma | D8662 | com Ca2+ e Mg2+ |
| PDX1 anticorpo | Abcam | ab47267 | 1:200 em imunofluorescência de montagem total |
| PE Mouse anti-GCG humano (camundongo IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2.000 em citometria de fluxo; usado para testar células de estágio 7 |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (camundongo IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 em citometria de fluxo |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (camundongo IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 em citometria de fluxo; usado para testar células de estágio 4 |
| PE Mouse IgG1κ Controle de Isotipo | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 em citometria de fluxo |
| PE Cromogranina A Humano-Camundongo (CHGA, IgG1k de camundongo) | BD Sciences | 564563 | 1:200 em citometria de fluxo |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL inibidor de tirosina quinase |
| Ácido retinóide, all-trans | Sigma | R2625 | |
| Tampão de lise RIPA sensível à luz, 10x | Sigma | 20-188 | Para extração hormonal |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | inibidor de SHH |
| SLC18A1 anticorpo | Sigma | HPA063797 | 1:200 em imunofluorescência de montagem total |
| Anticorpo de somatostatina | Sigma | HPA019472 | 1:100 em imunofluorescência de montagem total |
| STEMdiff Kit de progenitor pancreático STEMCELL | Technologies | 05120 | Meios basais e suplementos incluídos |
| Anticorpo de sinaptofisina | Novus | NB120-16659 | 1:25 em imunofluorescência de montagem total |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Para permeabilização |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | análogo da vitamina |
| E TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | reagente enzimático de dissociação celular para hPSCs de passagem de célula única |
| anticorpo Trypsin1/2/3 | R & D Systems | AF3586 | 1:25 em imunofluorescência de montagem total |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | inibidor de ROCK |
| Sulfato de zinco | Sigma | Z0251 | Suplemento médio |
Referências
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Shapiro, A. M., et al.
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Reimpressões e permissões
