Differensiering av stamceller til øyceller gir en alternativ løsning til konvensjonell diabetesbehandling og sykdomsmodellering. Vi beskriver en detaljert stamcellekulturprotokoll som kombinerer et kommersielt differensieringssett med en tidligere validert metode for å hjelpe til med å produsere insulinutskillende, stamcelleavledede øyer i en tallerken.
Differensiering av humane pluripotente stamceller (hPSCs) til insulinutskillende betaceller gir materiale for å undersøke betacellefunksjon og diabetesbehandling. Imidlertid gjenstår det utfordringer med å skaffe stamcelleavledede betaceller som tilstrekkelig etterligner innfødte humane betaceller. Basert på tidligere studier har hPSC-avledede øyceller blitt generert for å lage en protokoll med forbedrede differensieringsresultater og konsistens. Protokollen beskrevet her benytter et bukspyttkjertelprogenitorsett i trinn 1-4, etterfulgt av en protokoll modifisert fra et papir som tidligere ble publisert i 2014 (kalt “R-protokoll” heretter) under trinn 5-7. Detaljerte prosedyrer for bruk av pankreatisk stamcellesett og 400 μm diameter mikrobrønnplater for å generere bukspyttkjertelstamklynger, R-protokoll for endokrin differensiering i et 96-brønns statisk suspensjonsformat, og in vitro-karakterisering og funksjonell evaluering av hPSC-avledede øyer, er inkludert. Den komplette protokollen tar 1 uke for innledende hPSC-utvidelse etterfulgt av ~ 5 uker for å oppnå insulinproduserende hPSC-øyer. Personell med grunnleggende stamcellekulturteknikker og opplæring i biologiske analyser kan gjengi denne protokollen.
Beta-celler i bukspyttkjertelen utskiller insulin som reagerer på økninger i blodsukkernivået. Pasienter som mangler tilstrekkelig insulinproduksjon på grunn av autoimmun ødeleggelse av betaceller i type 1 diabetes (T1D)1, eller på grunn av betacelledysfunksjon ved type 2 diabetes (T2D)2, behandles vanligvis med eksogent insulin. Til tross for denne livreddende behandlingen, kan den ikke nøyaktig matche den utsøkte kontrollen av blodsukker som oppnås ved dynamisk insulinsekresjon fra bona fide betaceller. Som sådan lider pasienter ofte konsekvensene av livstruende hypoglykemiske episoder og andre komplikasjoner som følge av kroniske hyperglykemiske utflukter. Transplantasjon av humane kadaveriske øyer gjenoppretter vellykket stramt glykemisk kontroll hos T1D-pasienter, men er begrenset av tilgjengeligheten av øydonorer og vanskeligheter med å rense sunne øyer for transplantasjon 3,4. Denne utfordringen kan i prinsippet løses ved å bruke hPSC som et alternativt utgangsmateriale.
Nåværende strategier for å generere insulinutskillende øyer fra hPSCs in vitro tar ofte sikte på å etterligne prosessen med embryonal bukspyttkjertelutvikling in vivo 5,6. Dette krever kunnskap om de ansvarlige signalveiene og tidsbestemt tilsetning av tilsvarende løselige faktorer for å etterligne kritiske stadier av den utviklende embryonale bukspyttkjertelen. Bukspyttkjertelprogrammet starter med forpliktelsen til definitiv endoderm, som er preget av transkripsjonsfaktorer gaffelhodeboks A2 (FOXA2) og kjønnsbestemmende region Y-boks 17 (SOX17) 7. Suksessiv differensiering av definitiv endoderm innebærer dannelse av et primitivt tarmrør, mønster i en bakre fortarm som uttrykker bukspyttkjertelen og duodenal homeobox 1 (PDX1) 7,8,9, og epitelekspansjon til bukspyttkjertelprogenitorer som samtidig uttrykker PDX1 og NK6 homeobox 1 (NKX6.1) 10,11.
Videre forpliktelse til endokrine øyceller ledsages av forbigående ekspresjon av pro-endokrine masterregulatorneurogenin-3 (NGN3)12 og stabil induksjon av viktige transkripsjonsfaktorer: nevrondifferensiering 1 (NEUROD1) og NK2-homøoboks 2 (NKX2.2)13. De viktigste hormonuttrykkende cellene, som insulinproduserende betaceller, glukagonproduserende alfaceller, somatostatinproduserende deltaceller og pankreaspolypeptidproduserende PPY-celler, blir deretter programmert. Med denne kunnskapen, så vel som funn fra omfattende, high-throughput drug screening studier, har nyere fremskritt gjort det mulig å generere hPSC-øyer med celler som ligner betaceller i stand til insulinsekresjon 14,15,16,17,18,19.
Trinnvise protokoller har blitt rapportert for generering av glukoseresponsive betaceller 6,14,18,19. Bygget på disse studiene innebærer denne protokollen bruk av et pankreasprogenitorsett for generering av PDX1 + / NKX6.1+ pankreasprogenitorceller i en plan kultur, etterfulgt av mikrobrønnplateaggregering i ensartede klynger og ytterligere differensiering mot insulinutskillende hPSC-øyer med R-protokollen i en statisk 3D-suspensjonskultur. Kvalitetskontrollanalyser, inkludert flowcytometri, immunfarging og funksjonsvurdering, utføres for streng karakterisering av de differensierende cellene. Dette papiret gir en detaljert beskrivelse av hvert trinn i den rettede differensieringen og skisserer de vitro-karakteriseringsmetodene.
Denne artikkelen beskriver en syvtrinns hybridprotokoll som gjør det mulig å generere hPSC-øyer som er i stand til å utskille insulin ved glukoseeksponering innen 40 dager etter dyrkning in vitro. Blant disse flere trinnene antas effektiv induksjon av definitiv endoderm å sette et viktig utgangspunkt for de endelige differensieringsresultatene18,27,28. I produsentens protokoll anbefales en såtetthet ved 2,6 × 10<…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker støtten fra STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF og Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao og Shenghui Liang er mottakere av Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell JS Braam er mottaker av Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima er mottaker av Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship og CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Vi takker Dr. Edouard G. Stanley fra MCRI og Monash University for å dele Mel1 INS GFP / W-linjen og Alberta Diabetes Institute Islet Core for å isolere og distribuere menneskelige øyer. Vi anerkjenner også støtten fra Life Sciences Institute Imaging and Flow Cytometry-fasilitetene ved University of British Columbia. Figur 1 ble laget med BioRender.com.
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |