İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Adacık Kümelerine Farklılaşması
Summary
Kök hücrelerin adacık hücrelerine farklılaşması, geleneksel diyabet tedavisine ve hastalık modellemesine alternatif bir çözüm sunar. Bir tabakta insülin salgılayan, kök hücreden türetilen adacıkların üretilmesine yardımcı olmak için ticari bir farklılaşma kitini önceden onaylanmış bir yöntemle birleştiren ayrıntılı bir kök hücre kültürü protokolünü açıklıyoruz.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC’ler) insülin salgılayan beta hücrelerine farklılaşması, beta hücre fonksiyonunu ve diyabet tedavisini araştırmak için materyal sağlar. Bununla birlikte, doğal insan beta hücrelerini yeterince taklit eden kök hücre kaynaklı beta hücrelerinin elde edilmesinde zorluklar devam etmektedir. Önceki çalışmalara dayanarak, gelişmiş farklılaşma sonuçları ve tutarlılığı olan bir protokol oluşturmak için hPSC’den türetilmiş adacık hücreleri üretilmiştir. Burada açıklanan protokol, Aşama 1-4 sırasında bir pankreas progenitör kiti kullanır, ardından Aşama 5-7 sırasında daha önce 2014’te yayınlanan bir makaleden (bundan sonra “R-protokolü” olarak adlandırılacaktır) değiştirilmiş bir protokol kullanır. Pankreas progenitör kümeleri oluşturmak için pankreatik progenitör kiti ve 400 μm çaplı mikrokuyu plakaları, 96 oyuklu statik süspansiyon formatında endokrin farklılaşması için R protokolü ve hPSC’den türetilen adacıkların in vitro karakterizasyonu ve fonksiyonel değerlendirmesi için ayrıntılı prosedürler dahildir. Protokolün tamamı, ilk hPSC genişlemesi için 1 hafta sürer, ardından insülin üreten hPSC adacıkları elde etmek için ~ 5 hafta sürer. Temel kök hücre kültürü tekniklerine ve biyolojik tahliller konusunda eğitim almış personel bu protokolü çoğaltabilir.
Introduction
Pankreas beta hücreleri, kan şekeri seviyelerindeki artışlara yanıt vererek insülin salgılar. Tip 1 diyabette (T1D)1 beta hücrelerinin otoimmün yıkımı veya tip 2 diyabette (T2D)2 beta hücre disfonksiyonu nedeniyle yeterli insülin üretimi olmayan hastalar tipik olarak ekzojen insülin uygulaması ile tedavi edilir. Bu hayat kurtarıcı tedaviye rağmen, iyi niyetli beta hücrelerinden dinamik insülin sekresyonu ile elde edilen kan şekerinin mükemmel kontrolüyle tam olarak eşleşemez. Bu nedenle, hastalar genellikle hayatı tehdit eden hipoglisemik atakların ve kronik hiperglisemik gezilerden kaynaklanan diğer komplikasyonların sonuçlarından muzdariptir. İnsan kadavra adacıklarının transplantasyonu, T1D hastalarında sıkı glisemik kontrolü başarılı bir şekilde geri kazandırır, ancak adacık donörlerinin mevcudiyeti ve transplantasyon için sağlıklı adacıkların saflaştırılmasındaki zorluklar nedeniyle sınırlıdır 3,4. Bu zorluk, prensip olarak, alternatif bir başlangıç malzemesi olarak hPSC’ler kullanılarak çözülebilir.
İn vitro olarak hPSC’lerden insülin salgılayan adacıklar oluşturmak için mevcut stratejiler genellikle embriyonik pankreas gelişim sürecini in vivo 5,6 taklit etmeyi amaçlamaktadır. Bu, sorumlu sinyal yollarının bilinmesini ve gelişmekte olan embriyonik pankreasın kritik aşamalarını taklit etmek için karşılık gelen çözünür faktörlerin zamanlanmış eklenmesini gerektirir. Pankreas programı, transkripsiyon faktörleri çatal başlı kutu A2 (FOXA2) ve cinsiyet belirleyici bölge Y-kutusu 17 (SOX17)7 ile işaretlenen kesin endoderm taahhüdü ile başlar. Kesin endodermin ardışık farklılaşması, pankreas ve duodenal homeobox 1’i (PDX1)7,8,9 eksprese eden bir posterior ön bağırsağa desenlenen ilkel bir bağırsak tüpünün oluşumunu ve PDX1 ve NK6 homeobox 1’i (NKX6.1)10,11 birlikte eksprese eden pankreas progenitörlerine epitelyal genişlemeyi içerir.
Endokrin adacık hücrelerine daha fazla bağlılığa, pro-endokrin ana düzenleyici nörogenin-3’ün (NGN3)12 geçici ekspresyonu ve anahtar transkripsiyon faktörlerinin kararlı indüksiyonu eşlik eder: nöronal farklılaşma 1 (NEUROD1) ve NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. İnsülin üreten beta hücreleri, glukagon üreten alfa hücreleri, somatostatin üreten delta hücreleri ve pankreas polipeptit üreten PPY hücreleri gibi ana hormon eksprese eden hücreler daha sonra programlanır. Bu bilgi birikiminin yanı sıra kapsamlı, yüksek verimli ilaç tarama çalışmalarından elde edilen keşiflerle, son gelişmeler, insülin salgılayabilen beta hücrelerine benzeyen hücrelerle hPSC adacıklarının üretilmesini sağlamıştır 14,15,16,17,18,19.
Glikoza duyarlı beta hücreleri üretmek için adım adım protokoller bildirilmiştir 6,14,18,19. Bu çalışmalara dayanarak, mevcut protokol, düzlemsel bir kültürde PDX1 + / NKX6.1 + pankreas progenitör hücreleri oluşturmak için bir pankreas progenitör kitinin kullanılmasını, ardından tek tip boyutlu kümeler halinde mikrokuyu plakası agregasyonunu ve statik bir 3D süspansiyon kültüründe R protokolü ile insülin salgılayan hPSC adacıklarına doğru daha fazla farklılaşmayı içerir. Farklılaşan hücrelerin titiz karakterizasyonu için akış sitometrisi, immün boyama ve fonksiyonel değerlendirme dahil olmak üzere kalite kontrol analizleri yapılır. Bu makale, yönlendirilmiş farklılaşmanın her adımının ayrıntılı bir tanımını sağlar ve in vitro karakterizasyon yaklaşımlarını ana hatlarıyla belirtir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, in vitro kültürden sonraki 40 gün içinde glikoz tehdidi üzerine insülin salgılayabilen hPSC adacıklarının üretilmesine izin veren yedi aşamalı bir hibrit protokolü açıklamaktadır. Bu çoklu adımlar arasında, kesin endodermin etkin indüksiyonunun, nihai farklılaşma sonuçlarıiçin önemli bir başlangıç noktası oluşturduğuna inanılmaktadır 18,27,28. Üreticinin protokolünde, fark…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri’nin desteğini minnetle kabul ediyoruz. Jia Zhao ve Shenghui Liang, Michael Smith Sağlık Araştırmaları BC Stajyer Ödülü’nün sahipleridir. Mitchell J.S. Braam, Mitacs Hızlandırma Bursu’nun bir alıcısıdır. Diepiriye G. Iworima, Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu ve CFUW 1989 Ecole Polytechnique Hatıra Ödülü sahibidir. MCRI ve Monash Üniversitesi’nden Dr. Edouard G. Stanley’e Mel1 INS GFP/W hattını ve Alberta Diyabet Enstitüsü Adacık Çekirdeği’ni insan adacıklarını izole ettiği ve dağıttığı için içtenlikle teşekkür ederiz. Ayrıca British Columbia Üniversitesi’ndeki Yaşam Bilimleri Enstitüsü Görüntüleme ve Akış Sitometrisi tesislerinin desteğini de kabul ediyoruz. Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
Referências
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
- Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
- Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
- Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
- Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
- Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
- Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
- Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
- Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
