השראת דלקת חניכיים באמצעות שילוב של ליגטורה והזרקת ליפופוליסכריד במודל חולדה
Summary
במחקר זה, מודל חולדה של השראת דלקת חניכיים מוצג באמצעות שילוב של ליגטורה חוזרת וזריקות חוזרות ונשנות של ליפופוליסכריד שמקורו בפורפירומונס חניכיים, במשך 14 יום סביב הטוחנות המקסילריות הראשונות. טכניקות הקשירה וההזרקה LPS היו יעילות בגרימת דלקת פרידונטיקה, וכתוצאה מכך אובדן עצם מכתשית ודלקת.
Abstract
פריודונטיטיס (PD) היא מחלה דלקתית-חיסונית כרונית שכיחה ביותר של החניכיים, הגורמת לאובדן רקמת חניכיים רכה, רצועה פריודונטלית, צמנטום ועצם מכתשית. במחקר זה מתוארת שיטה פשוטה של השראת פרקינסון בחולדות. אנו מספקים הוראות מפורטות למיקום מודל הליגטורה סביב הטוחנות המקסילריות הראשונות (M1) ושילוב של זריקות ליפופוליסכריד (LPS), הנגזר מחניכיים מסוג Porphyromonas בצד המזיו-פלטלי של M1. השראת דלקת חניכיים נשמרה במשך 14 יום, קידום הצטברות של חיידקים, ביופילם ודלקת. כדי לאמת את המודל של בעלי החיים, IL-1β, מתווך דלקתי מרכזי, נקבע על ידי בדיקה חיסונית בנוזל החניכיים (GCF), ואובדן עצם מכתשית חושב באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת של קרן חרוט (CBCT). טכניקה זו הייתה יעילה בקידום נסיגת חניכיים, אובדן עצם מכתשית ועלייה ברמות IL-1β ב- GCF בסוף הליך הניסוי לאחר 14 יום. שיטה זו הייתה יעילה בגרימת מחלת פרקינסון, ובכך ניתן היה להשתמש בה במחקרים על מנגנוני התקדמות המחלה וטיפולים אפשריים בעתיד.
Introduction
דלקת חניכיים (PD) היא מחלת בריאות הציבור השישית בשכיחותה בעולם, המשפיעה על כ-11% מכלל האוכלוסייה, בהיותה צורה מתקדמת, בלתי הפיכה והרסנית של מחלת חניכיים 1,2. PD הוא תהליך דלקתי המשפיע על רקמות החניכיים והחניכיים, הגורם לנסיגת חניכיים, נדידה אפיקלית של אפיתל צומת עם התפתחות כיס, ואובדן עצם מכתשית3. יתר על כן, מחלת פרקינסון קשורה למספר מחלות מערכתיות, כולל מחלות לב וכלי דם, השמנת יתר, סוכרת ודלקת מפרקים שגרונית, שעבורן גורמים סביבתיים וספציפיים למארח ממלאים תפקיד משמעותי 4,5.
לפיכך, פרקינסון היא מחלה רב-גורמית הנגרמת בעיקר על ידי הצטברות של פלאק מיקרוביאלי – הנובע מדיסביוזה של קהילות מיקרוביאליות – ועל ידי תגובה חיסונית מוגזמת של המאכסן לפתוגנים חניכיים, מה שמוביל לפירוק רקמת חניכיים 4,6. מבין מספר חיידקי חניכיים, החיידק האנאירובי הגראם-שלילי Porphyromonas gingivalis הוא אחד הפתוגנים המרכזיים במחלת פרקינסון4. P. gingivalis מכיל ליפופוליסכריד מורכב (LPS) בדפנותיו, מולקולה הידועה כגורמת להסננת לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים ולהרחבת כלי הדם ברקמות חניכיים דלקתיות7. התוצאה היא ייצור של מתווכי דלקת, כגון אינטרלוקין 1 (IL-1), IL-6 ו- IL-8, גורם נמק גידולי (TNF), או פרוסטגלנדינים, עם הפעלת אוסטאוקלסטים וספיגת עצם לאחר מכן, מה שמוביל להרס רקמות ולאובדן שיניים סופי3.
בין היתרונות השונים של מודלים בבעלי חיים ניתן למנות את היכולת לחקות מורכבויות תאיות כמו בבני אדם, או להיות מדויקים יותר מאשר מחקרי מבחנה , המתבצעים על משטחי פלסטיק עם סוגי תאים מוגבלים8. לצורך מידול ניסויי של PD in vivo, נעשה שימוש במינים שונים של בעלי חיים, כמו פרימטים לא אנושיים, כלבים, חזירים, חמוסים, ארנבות, עכברים וחולדות9. עם זאת, חולדות הן המודל הנחקר ביותר בבעלי חיים עבור הפתוגנזה של פרקינסון מכיוון שהן זולות וקלות לטיפול10. לרקמת החניכיים הדנטלית שלהם יש תכונות מבניות דומות לרקמת חניכיים אנושית, עם חריץ חניכיים רדוד ואפיתל צומת המחוברים לפני השטח של השן. יתר על כן, כמו בבני אדם, אפיתל צומת מאפשר מעבר של חיידקים זרים, ומפריש מתאים דלקתיים 9.
אחד המודלים הניסיוניים המדווחים ביותר של השראת פרקינסון בחולדות הוא מיקום הליגטורות סביב השיניים, שהוא מאתגר מבחינה טכנית אך אמין10. מיקום הליגטורה מאפשר הצטברות רובד שיניים וחיידקים, ויוצר דיסביוזיס בסולצ’י החניכיים, הגורם לדלקת והרס רקמת חניכיים11. אובדן התקשרות חניכיים וספיגה מחדש של עצם מכתשית יכול להתרחש תוך 7 ימים במודל חולדהזה 8.
מודל נוסף של בעלי חיים לפרקינסון מורכב מהזרקת LPS לרקמת החניכיים. כתוצאה מכך, osteoclastogenesis ואובדן עצם מגורים. המאפיינים ההיסטופתולוגיים של מודל זה דומים לפרקינסון שהוקם על ידי בני אדם, ומאופיין ברמות גבוהות יותר של ציטוקינים מעודדי דלקת, פירוק קולגן וספיגת עצם מכתשית 6,8.
לפיכך, מטרת מחקר זה הייתה לתאר מודל פשוט של חולדה של PD ניסיוני המבוסס על טכניקות של זריקות P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), בשילוב עם מיקום רצועות סביב הטוחנות המקסילריות הראשונות (M1). זהו מודל בעל מאפיינים דומים לאלה שנצפו במחלת פרקינסון בבני אדם, אשר יכול לשמש לחקר מנגנוני התקדמות המחלה וטיפולים אפשריים עתידיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו מתארת השראת פרקינסון בחולדות בעקבות טכניקה משולבת של זריקות Pg-LPS ומיקום רצועות סביב M1, וחושפת כי ניתן לגרום לשינויים משמעותיים ברקמות החניכיים ובעצם הנאדית תוך 14 יום לאחר שיטה זו.
במהלך הליך זה, יש לתת תשומת לב לשלבים קריטיים שונים. במהלך הרדמת בעלי חיים והכנת פר…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (הוכחת היתכנות קריאה 2020), על ידי Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית ESF והקרן האירופית לפיתוח אזורי ERDF (חוזה ל- M.M.B; FI18/00104) ועל ידי Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (חוזה עם M.M.F.C; פ/040/2020). המחברים מודים לד”ר אנה תומס ומריה טורטוסה על עזרתן בניתוח הניסויי ובפלטפורמה של IdISBa. לבסוף, תודה לבית הספר לרפואת שיניים ADEMA על הגישה לסורק CBCT.
Materials
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
Referências
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
