ラットモデルにおける結紮糸とリポ多糖の注射 の組み合わせによる 歯周炎の誘発
Summary
この研究では、歯周炎の誘発のラットモデルが、保持性結紮糸とポルフィロモナスジンジバリス由来のリポ多糖の反復注射の組み合わせを介して提示されます、 第一上顎大臼歯の周り14日間。結紮術とLPS注射法は歯膜炎の誘発に有効であり、歯槽骨量減少と炎症を引き起こしました。
Abstract
歯周炎(PD)は、歯周組織の非常に蔓延している慢性免疫炎症性疾患であり、歯肉軟部組織、歯周靭帯、セメント質、および歯槽骨の喪失をもたらします。本研究では、ラットにおけるPD誘導の簡便な方法について説明する。第1上顎大臼歯(M1)の周りに結紮モデルを配置するための詳細な手順と、M1の中口蓋側に ポルフィロモナスジンジバリス に由来するリポ多糖(LPS)の注射の組み合わせを提供します。歯周炎の誘発は14日間維持され、細菌バイオフィルムの蓄積と炎症を促進しました。動物モデルを検証するために、重要な炎症メディエーターであるIL-1βを歯肉溝液(GCF)のイムノアッセイによって決定し、歯槽骨量減少をコーンビームコンピューター断層撮影(CBCT)を使用して計算しました。この技術は、14日後の実験手順の終了時に、歯肉退縮、歯槽骨量減少、およびGCFのIL-1βレベルの増加を促進するのに効果的でした。この方法はPDの誘導に有効であり、疾患の進行メカニズムや将来の可能な治療法に関する研究に使用することができます。
Introduction
歯周炎(PD)は、世界で6番目に蔓延している公衆衛生状態であり、総人口の約11%に影響を及ぼし、進行性、不可逆的、破壊的な形態の歯周病です1,2。PDは、歯肉および歯周組織に影響を与える炎症過程であり、歯肉退縮、ポケット発達を伴う接合部上皮の頂端移動、および歯槽骨の喪失をもたらします3。さらに、PDは、心血管疾患、肥満、糖尿病、関節リウマチなどのいくつかの全身性疾患に関連しており、環境および宿主特異的要因が重要な役割を果たします4,5。
したがって、PDは、主に微生物群集の嚥下障害に起因する微生物プラークの蓄積と、歯周病原菌に対する誇張された宿主免疫応答によって開始され、歯周組織の破壊につながる多因子性疾患です4,6。いくつかの歯周病細菌の中で、グラム陰性嫌気性細菌ポルフィロモナス・ジンジバリスはPD4の重要な病原体の1つです。P. gingivalisは、その壁に複雑なリポ多糖(LPS)を含み、炎症を起こした歯周組織において多形核白血球浸潤および血管拡張を誘導することが知られている分子である7。これにより、インターロイキン1(IL-1)、IL-6、IL-8、腫瘍壊死因子(TNF)、プロスタグランジンなどの炎症メディエーターが産生され、その後破骨細胞の活性化と骨吸収が行われ、組織破壊と究極の歯の喪失につながります3。
動物モデルのさまざまな利点の中には、人間のように細胞の複雑さを模倣する能力、または限られた細胞タイプのプラスチック表面で実施される in vitro 研究よりも正確である能力が含まれます8。 PDをin vivoで実験的にモデル化するために、非ヒト霊長類、イヌ、ブタ、フェレット、ウサギ、マウス、およびラットなどの異なる動物種が使用されてきた9。しかし、ラットは安価で取り扱いが容易であるため、PDの病因について最も広く研究されている動物モデルです10。それらの歯肉組織は、人間の歯肉組織と同様の構造的特徴を持ち、浅い歯肉溝と接合部上皮が歯の表面に付着しています。さらに、ヒトと同様に、接合部上皮は、細菌、異物、および炎症細胞からの滲出液の通過を容易にする 9。
ラットにおけるPD誘導の最も報告されている実験モデルの1つは、歯の周りに結紮糸を配置することであり、これは技術的には困難ですが、信頼性があります10。結紮糸の配置は、歯垢と細菌の蓄積を促進し、歯肉溝に嚥下障害を引き起こし、歯周組織の炎症と破壊を引き起こします11。歯周付着の喪失と歯槽骨の再吸収は、このラットモデル8で7日間で発生する可能性があります。
PDの別の動物モデルは、歯肉組織へのLPSの注射からなる。その結果、破骨細胞形成と骨量減少が刺激されます。このモデルの組織病理学的特徴は、炎症誘発性サイトカインのレベルが高く、コラーゲン分解、および歯槽骨吸収を特徴とするヒトが確立したPDに似ています6,8。
したがって、この研究の目的は、 P.ジンジバリス-LPS(Pg-LPS)注射の技術に基づく実験的PDの単純なラットモデルと、最初の上顎大臼歯(M1)の周りの結紮糸配置を組み合わせることでした。これは、ヒトPD疾患で観察されたものと同様の特性を持つモデルであり、疾患の進行メカニズムと将来の可能な治療法の研究に使用できる可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法は、 Pg-LPS注射とM1周囲の結紮糸配置を組み合わせた手法によるラットにおけるPDの誘導を説明し、この方法の後14日で歯周組織と歯槽骨の有意な変化を誘発できることを明らかにしました。
この手順では、さまざまな重要な手順に注意を払う必要があります。動物の麻酔と手技の準備中、動物の正しい位置を確保し、切歯の周りにアルミニウム製の口のギ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、ESF欧州社会基金とERDF欧州地域開発基金(M.M.Bとの契約)が共同出資した、サルードカルロス3世研究所(概念実証コール2020)の支援を受けました。FI18/00104)およびDirecció General d’Investigació、Conselleria d’Investigació、Govern Balear(M.M.F.C;FPI / 040/2020)。著者らは、IdISBaの実験的手術とプラットフォームでの支援について、アンナ・トマス博士とマリア・トルトサ博士に感謝します。最後に、CBCTスキャナーにアクセスしてくれたADEMA歯学部に感謝します。
Materials
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
Referências
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
