Индукция пародонтита с помощью комбинации лигатуры и инъекции липополисахарида на крысиной модели
Summary
В этом исследовании крысиная модель индукции пародонтита представлена с помощью комбинации ретенционной лигатуры и повторяющихся инъекций липополисахарида, полученного из Porphyromonas gingivalis, в течение 14 дней вокруг первых верхнечелюстных моляров. Методы лигирования и инъекции ЛПС были эффективны в индуцировании перидонтита, что приводило к потере альвеолярной кости и воспалению.
Abstract
Пародонтит (БП) является широко распространенным хроническим иммуновоспалительным заболеванием пародонта, которое приводит к потере мягких тканей десны, периодонтальной связки, цемента и альвеолярной кости. В данном исследовании описан простой метод индукции БП у крыс. Мы предоставляем подробные инструкции по размещению лигатурной модели вокруг первых верхнечелюстных моляров (M1) и комбинации инъекций липополисахарида (LPS), полученного из Porphyromonas gingivalis на мезио-небной стороне M1. Индукция пародонтита сохранялась в течение 14 дней, способствуя накоплению биопленки бактерий и воспалению. Для проверки животной модели IL-1β, ключевой медиатор воспаления, был определен с помощью иммуноанализа в десневой щелевой жидкости (ЗКФ), а потеря альвеолярной кости была рассчитана с использованием конусно-лучевой компьютерной томографии (КЛКТ). Этот метод был эффективен в стимулировании рецессии десны, потери альвеолярной кости и повышения уровня IL-1β в ЗКФ в конце экспериментальной процедуры через 14 дней. Этот метод был эффективен в индуцировании БП, поэтому его можно было использовать в исследованиях механизмов прогрессирования заболевания и будущих возможных методов лечения.
Introduction
Пародонтит (БП) является шестым по распространенности заболеванием общественного здравоохранения во всем мире, затрагивающим примерно 11% всего населения, являясь прогрессирующей, необратимой и деструктивной формой заболевания пародонта 1,2. БП – воспалительный процесс, поражающий ткани десны и пародонта, в результате чего происходит рецессия десны, апикальная миграция соединительного эпителия с развитием кармана, потеря альвеолярной кости3. Кроме того, болезнь Паркинсона связана с несколькими системными заболеваниями, включая сердечно-сосудистые заболевания, ожирение, диабет и ревматоидный артрит, для которых факторы окружающей среды и хозяина играют значительную роль 4,5.
Следовательно, БП является многофакторным заболеванием, инициируемым в первую очередь накоплением микробного налета в результате дисбактериоза микробных сообществ и преувеличенным иммунным ответом хозяина на патогены пародонта, что приводит к разрушению ткани пародонта 4,6. Среди нескольких пародонтальных бактерий грамотрицательная анаэробная бактерия Porphyromonas gingivalis является одним из ключевых патогенов PD4. P. gingivalis содержит в своих стенках сложный липополисахарид (ЛПС), молекулу, которая, как известно, индуцирует полиморфноядерную инфильтрацию лейкоцитов и расширение сосудов в воспаленных тканях пародонта7. Это приводит к выработке медиаторов воспаления, таких как интерлейкин 1 (IL-1), IL-6 и IL-8, фактор некроза опухоли (TNF) или простагландины, с последующей активацией остеокластов и резорбцией кости, что приводит к разрушению тканей и окончательной потере зубов3.
К различным преимуществам животных моделей можно отнести способность имитировать клеточные сложности, как у людей, или быть более точными, чем исследования in vitro , которые проводятся на пластиковых поверхностях с ограниченными типами клеток8. Для экспериментального моделирования БП in vivo использовались различные виды животных, такие как нечеловекообразные приматы, собаки, свиньи, хорьки, кролики, мыши и крысы9. Тем не менее, крысы являются наиболее широко изученной животной моделью патогенеза БП, потому что они недороги и просты в обращении10. Их зубная десневая ткань имеет схожие структурные особенности с десневой тканью человека, с неглубокой десневой бороздой и соединительным эпителием, прикрепленным к поверхности зуба. Кроме того, как и у человека, соединительный эпителий облегчает прохождение бактериальных, чужеродных материалов и экссудата из воспалительных клеток 9.
Одной из наиболее известных экспериментальных моделей индукции БП у крыс является размещение лигатур вокруг зубов, что технически сложно, но надежно10. Размещение лигатуры способствует образованию зубного налета и накоплению бактерий, вызывая дисбактериоз в десневых бороздах, что вызывает воспаление и разрушение тканей пародонта11. Потеря прикрепления пародонта и резорбция альвеолярной кости могут произойти через 7 дней у этой крысы модели8.
Другая животная модель БП состоит из инъекции ЛПС в десневую ткань. В результате стимулируется остеокластогенез и потеря костной массы. Гистопатологические особенности этой модели сходны с установленной человеком болезнью Паркинсона, характеризуются более высокими уровнями провоспалительных цитокинов, деградацией коллагена и резорбцией альвеолярной кости 6,8.
Таким образом, целью данного исследования было описание простой модели экспериментальной БП на крысах, основанной на методах инъекций P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) в сочетании с размещением лигатуры вокруг первых верхнечелюстных моляров (M1). Это модель с характеристиками, аналогичными тем, которые наблюдаются при заболевании БП человека, которая может быть использована при изучении механизмов прогрессирования заболевания и будущих возможных методов лечения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод описывает индукцию БП у крыс после комбинированной техники инъекций Pg-LPS и размещения лигатуры вокруг M1, показывая, что значительные изменения в тканях пародонта и альвеолярной кости могут быть вызваны через 14 дней после этого метода.
Во время этой процед?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept call 2020), Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, совместно финансируемым Европейским социальным фондом ESF и Европейским фондом регионального развития ERDF (контракт с M.M.B; FI18/00104) и Генеральным управлением расследований, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (контракт с M.M.F.C.; FPI/040/2020). Авторы благодарят доктора Анну Томас и Марию Тортосу за их помощь в экспериментальной хирургии и платформе IdISBa. Наконец, спасибо Школе стоматологии ADEMA за доступ к сканеру КЛКТ.
Materials
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
Referências
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
