Induktion av parodontit via en kombination av ligatur och lipopolysackarid injektion i en råttmodell
Summary
I denna studie presenteras en råttmodell av induktion av parodontit via en kombination av retentiv ligatur och repetitiva injektioner av lipopolysackarid härrörande från Porphyromonas gingivalis, under 14 dagar runt de första maxillära molarna. Ligerings- och LPS-injektionsteknikerna var effektiva för att inducera peridontit, vilket resulterade i alveolär benförlust och inflammation.
Abstract
Parodontit (PD) är en mycket utbredd, kronisk immuninflammatorisk sjukdom i parodontium, vilket resulterar i förlust av tandköttets mjukvävnad, parodontalt ligament, cementum och alveolärt ben. I denna studie beskrivs en enkel metod för PD-induktion hos råtta. Vi tillhandahåller detaljerade instruktioner för placering av ligaturmodellen runt de första maxillära molarna (M1) och en kombination av injektioner av lipopolysackarid (LPS), härrörande från Porphyromonas gingivalis på mesio-palatala sidan av M1. Induktionen av parodontit upprätthölls i 14 dagar, vilket främjade ackumulering av bakterier biofilm och inflammation. För att validera djurmodellen bestämdes IL-1β, en viktig inflammatorisk mediator, genom en immunanalys i gingival crevicular fluid (GCF), och alveolär benförlust beräknades med hjälp av cone beam computed tomography (CBCT). Denna teknik var effektiv för att främja tandköttsrecession, alveolär benförlust och en ökning av IL-1β-nivåerna i GCF i slutet av experimentproceduren efter 14 dagar. Denna metod var effektiv för att inducera PD och kunde därmed användas i studier av sjukdomsprogressionsmekanismer och framtida möjliga behandlingar.
Introduction
Parodontit (PD) är det sjätte vanligaste folkhälsotillståndet över hela världen och påverkar cirka 11% av den totala befolkningen, vilket är en avancerad, irreversibel och destruktiv form av periodontal sjukdom 1,2. PD är en inflammatorisk process som påverkar tandkötts- och parodontala vävnader, vilket resulterar i tandköttsrecession, apikal migration av korsningsepitelet med fickutveckling och förlust av alveolärt ben3. Dessutom är PD associerat med flera systemiska sjukdomar, inklusive hjärt-kärlsjukdom, fetma, diabetes och reumatoid artrit, för vilka miljö- och värdspecifika faktorer spelar en viktig roll 4,5.
Därför är PD en multifaktoriell sjukdom som främst initieras av ackumulering av mikrobiell plack – till följd av dysbios av mikrobiella samhällen – och av ett överdrivet värdimmunsvar mot parodontala patogener, vilket leder till nedbrytning av parodontal vävnad 4,6. Bland flera parodontala bakterier är den gramnegativa anaeroba bakterien Porphyromonas gingivalis en av de viktigaste patogenerna i PD4. P. gingivalis innehåller en komplex lipopolysackarid (LPS) i sina väggar, en molekyl som är känd för att inducera polymorfonukleär leukocytinfiltration och vaskulär dilatation i inflammerade parodontala vävnader7. Detta resulterar i produktion av inflammatoriska mediatorer, såsom interleukin 1 (IL-1), IL-6 och IL-8, tumörnekrosfaktor (TNF) eller prostaglandiner, med en efterföljande osteoklastaktivering och benresorption, vilket leder till vävnadsförstörelse och slutlig tandförlust3.
Bland de olika fördelarna med djurmodeller ingår förmågan att efterlikna cellulära komplexiteter som hos människor, eller att vara mer exakt än in vitro-studier , som utförs på plastytor med begränsade celltyper8. För modellering av PD experimentellt in vivo har olika djurarter använts, som icke-mänskliga primater, hundar, grisar, illrar, kaniner, möss och råttor9. Råttor är dock den mest studerade djurmodellen för patogenesen av PD eftersom de är billiga och lätta att hantera10. Deras dentala tandköttsvävnad har liknande strukturella egenskaper som mänsklig tandköttsvävnad, med en grund gingival sulcus och junctional epitel fäst vid tandytan. Dessutom, som hos människor, underlättar korsningsepitelet passagen av bakteriella, främmande material och utsöndringar från inflammatoriska celler 9.
En av de mest rapporterade experimentella modellerna av PD-induktion hos råttor är placeringen av ligaturer runt tänderna, vilket är tekniskt utmanande men tillförlitligt10. Ligaturplaceringen underlättar tandplack och bakteriell ackumulering, vilket genererar en dysbios i tandköttssulci, som orsakar parodontal vävnadsinflammation och förstörelse11. Förlust av parodontal bindning och resorption av alveolärt ben kan inträffa inom 7 dagar i denna råttmodell8.
En annan djurmodell för PD består av injektion av LPS i tandköttsvävnaden. Som ett resultat stimuleras osteoklastogenes och benförlust. De histopatologiska egenskaperna hos denna modell liknar humant etablerad PD, kännetecknad av högre nivåer av proinflammatoriska cytokiner, kollagennedbrytning och alveolär benresorption 6,8.
Således var syftet med denna studie att beskriva en enkel råttmodell av experimentell PD baserad på teknikerna för P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) injektioner, kombinerat med ligaturplacering runt de första maxillära molarna (M1). Detta är en modell med liknande egenskaper som de som observerats vid human PD-sjukdom, som kan användas i studien av sjukdomsprogressionsmekanismer och framtida möjliga behandlingar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod beskriver induktionen av PD hos råttor efter en kombinerad teknik med Pg-LPS-injektioner och ligaturplacering runt M1, vilket avslöjar att signifikanta förändringar i parodontala vävnader och alveolärt ben kan induceras inom 14 dagar efter denna metod.
Under denna procedur måste uppmärksamhet ägnas åt olika kritiska steg. Under djurbedövning och procedurberedning är bedömning av korrekt anestesi under den kirurgiska processen avgörande för dess framgång, li…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept call 2020), av Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, medfinansierat av ESF Europeiska socialfonden och Eruf Europeiska regionala utvecklingsfonden (kontrakt till M.M.B; FI18/00104) och av Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (kontrakt med M.M.F.C; FPI/040/2020). Författarna tackar Dr. Anna Tomás och Maria Tortosa för deras hjälp vid den experimentella operationen och plattformen för IdISBa. Slutligen, tack till ADEMA School of Dentistry för tillgången till CBCT-skannern.
Materials
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
Referências
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
