Immunfarvningsbaseret påvisning af dynamiske ændringer i proteiner fra røde blodlegemer
Summary
Registrering af dynamiske ændringer i proteinaktiveringen af enukleerede røde blodlegemer udgør metodologiske udfordringer, som bevarelse af dynamiske ændringer i akutte stimuli til senere vurdering. Den præsenterede protokol beskriver prøveforberedelse og farvningsteknikker, der muliggør konservering og analyse af relevante proteinændringer og efterfølgende påvisning.
Abstract
Antistofmærkning af proteiner med røde blodlegemer (RBC) er en almindeligt anvendt, semikvantitativ metode til påvisning af ændringer i det samlede proteinindhold eller akutte ændringer i proteinaktiveringstilstande. Det letter vurderingen af RBC-behandlinger, karakterisering af forskelle i visse sygdomstilstande og beskrivelse af cellulære kohærenser. Påvisning af akut ændret proteinaktivering (f.eks. gennem mekanotransduktion) kræver tilstrækkelig prøveforberedelse for at bevare ellers midlertidige proteinmodifikationer. Det grundlæggende princip omfatter immobilisering af målbindingsstederne for de ønskede RBC-proteiner for at muliggøre den indledende binding af specifikke primære antistoffer. Prøven behandles yderligere for at sikre optimale betingelser for binding af det sekundære antistof til det tilsvarende primære antistof. Udvælgelsen af ikke-fluorescerende sekundære antistoffer kræver yderligere behandling, herunder biotin-avidin-kobling og anvendelse af 3,3-diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB) for at udvikle farvningen, som skal kontrolleres i realtid under et mikroskop for at stoppe oxidationen og dermed farvningsintensiteten til tiden. Til detektion af farvningsintensitet tages billeder ved hjælp af et standard lysmikroskop. I en modifikation af denne protokol kan et fluoresceinkonjugeret sekundært antistof anvendes i stedet, hvilket har den fordel, at der ikke er behov for yderligere udviklingstrin. Denne procedure kræver imidlertid et fluorescensmål fastgjort til et mikroskop til farvningsdetektion. I betragtning af disse metoders semikvantitative karakter er det bydende nødvendigt at tilvejebringe flere kontrolpletter for at tage højde for ikke-specifikke antistofreaktioner og baggrundssignaler. Her præsenterer vi både farvningsprotokoller og de tilsvarende analytiske processer for at sammenligne og diskutere de respektive resultater og fordele ved de forskellige farvningsteknikker.
Introduction
Røde blodlegemer (RBC’er) krydser det kardiovaskulære system i 70 til 140 dage med en gennemsnitlig RBC-alder på ca. 115 dage 1,2. Senescerende eller beskadigede RBC’er fjernes fra cirkulationen ved erythrofagocytose, en effektiv clearingproces drevet af makrofager3. Den forudbestemte levetid for disse celler er en konsekvens af overgivelse af celleorganellerne, herunder kernen, mitokondrier og ribosomer, under differentiering og modning4. Således er cirkulerende RBC’er blottet for et translationelt maskineri, der udelukker syntese af nye proteiner3. Det følger heraf, at dynamiske, posttranslationelle modifikationer af eksisterende proteiner repræsenterer den eneste levedygtige mekanisme for akut, biokemisk regulering som reaktion på ekstracellulære og intracellulære stressorer, der virker på RBC’er5.
Mekaniske kræfter synes at være de vigtigste ekstracellulære signaler, der forårsager aktivering eller modulering af biokemiske veje inden for RBC’er. Opdagelsen af det mekanofølsomme protein, Piezo1, i RBC-membraner6 inspirerede flere forskningslinjer, der undersøgte mekanisk aktiveret signalering i disse celler7. For eksempel har nylige fremskridt vist, at RBC’ernes fysiske egenskaber reguleres aktivt af akutte og dynamiske ændringer af proteiner8, som omfatter posttranslationel phosphorylering og ubiquitination9. Da disse normale modifikationer adskiller sig i visse sygdomme 9,10,11, synes det at være af videnskabelig og klinisk interesse at bestemme aktiveringstilstanden for RBC-proteiner, specifikt i forhold til mekanobiologiske processer.
Bestemmelsen af akutte ændringer i RBC-proteinaktiveringstilstande udgør nogle metodologiske udfordringer. For eksempel kræver opbevaring af RBC-prøver til senere analyse konservering af de modificerede RBC-proteiner, da posttranslationelle modifikationer er ikke-holdbare. Desuden er klassiske proteindetekteringsmetoder (f.eks. Western blotting) notorisk vanskelige at standardisere i RBC’er på grund af den lave overflod af proteiner i forhold til hæmoglobin, som tegner sig for ~ 98% af proteinindholdet i disse celler12. Antistofbaseret farvning af kemisk konserverede RBC’er har således været den foretrukne metode til undersøgelse af akutte modifikationer af vigtige RBC-proteiner, såsom den RBC-specifikke isoform af nitrogenoxidsyntase (RBC-NOS)13,14. RBC-NOS har vist sig enzymatisk at producere nitrogenoxid (NO), hvilket synes uundværligt for væsentlige RBC-egenskaber, herunder RBC-deformerbarhed15,16,17. Posttranslationelle modifikationer af RBC-NOS regulerer katalytisk enzymaktivitet, idet phosphorylering af serin 1177-resten beskrives for at øge enzymaktiviteten, mens phosphorylering af resterne serin 114 eller threonin 495 er blevet forbundet med nedsat RBC-NOS-aktivitet18,19.
Samlet set bidrager midlertidige modifikationer af RBC-proteiner til vigtig cellulær funktion, og standardiserede protokoller, der muliggør påvisning af disse modificerede proteiner, er af høj værdi. Her præsenterer vi to forskellige protokoller, der udnytter specifikke antistoffer til at lette påvisning af RBC-NOS-proteinaktivering, og diskuterer anbefalinger til dataanalyse og fortolkning.
De beskrevne protokollers ydeevne blev vurderet ved at måle den velrapporterede stigning i phosphoryleringen af RBC-NOS ved serin 1177-resterne som reaktion på mekaniske kræfter, der reflekteres af dem, der forekommer i den humane vaskulatur (5 Pa).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nyere litteratur tyder stærkt på, at RBC-NOS-proteinet er af afgørende betydning for reguleringen af RBC-deformerbarhed 15,22,23, hvilket igen letter deres passage gennem smalle kapillærer 24. Proteinaktivitet afhænger i høj grad af posttranslationelle proteinmodifikationer, især phosphoryleringen af visse restkoncentrationer18. Fokus af interesse ligger i fosforyleringsste…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LK anerkender støtten fra et australsk regeringsforskningsuddannelsesprogramstipendium.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
Referências
- Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
- Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
- Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die?. Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
- Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
- Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
- Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
- Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
- Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
- Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
- Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
- Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
- Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
- Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
- Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
- Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
- Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
- Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biologia. 10 (1), 47 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
- Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
- McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
- Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
- Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
- Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
- Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
- Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
- Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
- Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
- Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
- Feelisch, M. . Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).
