Rilevazione basata sull'immunocolorazione di alterazioni dinamiche nelle proteine dei globuli rossi
Summary
Catturare i cambiamenti dinamici nell’attivazione proteica dei globuli rossi enucleati pone sfide metodologiche, come la conservazione dei cambiamenti dinamici agli stimoli acuti per una valutazione successiva. Il protocollo presentato descrive la preparazione del campione e le tecniche di colorazione che consentono la conservazione e l’analisi dei cambiamenti proteici rilevanti e la successiva rilevazione.
Abstract
La marcatura anticorpale delle proteine dei globuli rossi (RBC) è un metodo semi-quantitativo comunemente usato per rilevare cambiamenti nel contenuto proteico complessivo o alterazioni acute negli stati di attivazione delle proteine. Facilita la valutazione dei trattamenti con globuli rossi, la caratterizzazione delle differenze in alcuni stati patologici e la descrizione delle coerenze cellulari. Il rilevamento di un’attivazione proteica acutamente alterata (ad esempio, attraverso la meccanotrasduzione) richiede un’adeguata preparazione del campione per preservare modificazioni proteiche altrimenti temporanee. Il principio di base include l’immobilizzazione dei siti di legame bersaglio delle proteine RBC desiderate per consentire il legame iniziale di specifici anticorpi primari. Il campione viene ulteriormente elaborato per garantire condizioni ottimali per il legame dell’anticorpo secondario all’anticorpo primario corrispondente. La selezione di anticorpi secondari non fluorescenti richiede un trattamento aggiuntivo, compreso l’accoppiamento biotina-avidina e l’applicazione di 3,3-diaminobenzidina-tetracloridrato (DAB) per sviluppare la colorazione, che deve essere controllata in tempo reale al microscopio per fermare l’ossidazione, e quindi l’intensità della colorazione, in tempo. Per il rilevamento dell’intensità della colorazione, le immagini vengono scattate utilizzando un microscopio ottico standard. In una modifica di questo protocollo, può essere applicato invece un anticorpo secondario coniugato con fluoresceina, che ha il vantaggio che non è necessaria alcuna ulteriore fase di sviluppo. Questa procedura, tuttavia, richiede un obiettivo di fluorescenza collegato a un microscopio per il rilevamento della colorazione. Data la natura semi-quantitativa di questi metodi, è imperativo fornire diverse colorazioni di controllo per tenere conto delle reazioni anticorpali non specifiche e dei segnali di fondo. Qui, presentiamo sia i protocolli di colorazione che i corrispondenti processi analitici per confrontare e discutere i rispettivi risultati e vantaggi delle diverse tecniche di colorazione.
Introduction
I globuli rossi (RBC) attraversano il sistema cardiovascolare per 70-140 giorni, con un’età media dei globuli rossi di circa 115 giorni 1,2. I globuli rossi senescenti o danneggiati vengono rimossi dalla circolazione mediante eritrofagocitosi, un efficiente processo di compensazione guidato dai macrofagi3. La durata della vita predeterminata di queste cellule è una conseguenza della resa degli organelli cellulari, incluso il nucleo, i mitocondri e i ribosomi, durante la differenziazione e la maturazione4. Pertanto, i globuli rossi circolanti sono privi di un meccanismo traslazionale, precludendo la sintesi di nuove proteine3. Ne consegue che le modificazioni dinamiche post-traduzionali delle proteine esistenti rappresentano l’unico meccanismo praticabile di regolazione biochimica acuta in risposta a fattori di stress extracellulari e intracellulari che agiscono sui globuli rossi5.
Le forze meccaniche sembrano essere i principali segnali extracellulari che causano l’attivazione o la modulazione dei percorsi biochimici all’interno dei globuli rossi. La scoperta della proteina meccanosensibile, Piezo1, nelle membrane RBC6 ha ispirato diverse linee di ricerca che studiano la segnalazione attivata meccanicamente in queste cellule7. Ad esempio, recenti progressi hanno dimostrato che le proprietà fisiche dei globuli rossi sono attivamente regolate da cambiamenti acuti e dinamici delle proteine8, che includono la fosforilazione post-traduzionale e l’ubiquitinazione9. Poiché queste normali modificazioni differiscono in alcune malattie 9,10,11, sembra essere di interesse scientifico e clinico determinare lo stato di attivazione delle proteine RBC, in particolare in relazione ai processi meccanobiologici.
La determinazione di cambiamenti acuti negli stati di attivazione della proteina RBC pone alcune sfide metodologiche. Ad esempio, la conservazione dei campioni di RBC per analisi successive richiede la conservazione delle proteine RBC modificate, poiché le modifiche post-traduzionali non sono durevoli. Inoltre, i metodi classici di rilevamento delle proteine (ad esempio, western blotting) sono notoriamente difficili da standardizzare nei globuli rossi a causa della bassa abbondanza di proteine rispetto all’emoglobina, che rappresenta ~ 98% del contenuto proteico in queste cellule12. Pertanto, la colorazione basata su anticorpi di globuli rossi conservati chimicamente è stato il metodo di scelta quando si studiano le modificazioni acute di importanti proteine RBC, come l’isoforma specifica dei globuli rossi dell’ossido nitrico sintasi (RBC-NOS)13,14. È stato dimostrato che RBC-NOS produce enzimaticamente ossido nitrico (NO), che sembra indispensabile per le proprietà essenziali dei globuli rossi, inclusa la deformabilità dei globuli rossi15,16,17. Le modificazioni post-traduzionali di RBC-NOS regolano l’attività enzimatica catalitica, con la fosforilazione del residuo di serina 1177 descritta per aumentare l’attività enzimatica, mentre la fosforilazione dei residui serina 114 o treonina 495 è stata collegata a una diminuzione dell’attività RBC-NOS18,19.
Collettivamente, le modifiche temporanee delle proteine RBC contribuiscono a importanti funzioni cellulari e i protocolli standardizzati che consentono il rilevamento di queste proteine modificate sono di alto valore. Qui, presentiamo due protocolli distinti che sfruttano anticorpi specifici per facilitare la rilevazione dell’attivazione della proteina RBC-NOS e discutiamo le raccomandazioni per l’analisi e l’interpretazione dei dati.
Le prestazioni dei protocolli descritti sono state valutate misurando l’aumento ben riportato della fosforilazione di RBC-NOS al residuo di serina 1177 in risposta a forze meccaniche riflettenti quelle che si verificano all’interno del sistema vascolaristico umano (5 Pa).
Protocol
Representative Results
Discussion
La letteratura recente suggerisce altamente che la proteina RBC-NOS è di cruciale importanza per la regolazione della deformabilità dei globuli rossi 15,22,23, che a sua volta facilita il loro passaggio attraverso capillari stretti 24. L’attività proteica dipende fortemente dalle modificazioni proteiche post-traduzionali, in particolare dalla fosforilazione di alcuni residui18….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LK riconosce il sostegno di una borsa di studio del programma di formazione alla ricerca del governo australiano.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
Referências
- Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
- Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
- Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die?. Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
- Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
- Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
- Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
- Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
- Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
- Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
- Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
- Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
- Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
- Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
- Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
- Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
- Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
- Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biologia. 10 (1), 47 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
- Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
- McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
- Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
- Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
- Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
- Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
- Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
- Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
- Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
- Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
- Feelisch, M. . Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).
