طريقة ثقافة 3D من كرويات من خطوط خلايا الزرد الجنينية والكبد
Summary
هنا ، نقدم بروتوكول ثقافة 3D فعال وسهل وسريع لتشكيل كرويات من خطين خلويين من الزرد (Danio rerio): ZEM2S (الجنين) و ZFL (خلايا الكبد الطبيعية).
Abstract
تعتبر خطوط الخلايا السمكية نماذج مخبرية واعدة لتقييم السمية الإيكولوجية. ومع ذلك ، فإن أنظمة الاستزراع أحادية الطبقة التقليدية (ثقافة 2D) لها قيود معروفة (على سبيل المثال ، طول عمر الثقافة والحفاظ على بعضها في الوظائف الخلوية في الجسم الحي ). وهكذا ، تم اقتراح ثقافات 3D ، مثل الكروية ، لأن هذه النماذج يمكنها إعادة إنتاج الهياكل الشبيهة بالأنسجة ، واستعادة الظروف في الجسم الحي بشكل أفضل. توضح هذه المقالة بروتوكول ثقافة 3D فعال وسهل وسريع لتشكيل كرويات مع اثنين من خطوط خلايا الزرد (Danio rerio): ZEM2S (الجنين) و ZFL (خلايا الكبد الطبيعية). يتكون البروتوكول من طلاء الخلايا في لوحة مستديرة القاع ، منخفضة للغاية ، 96 بئرا. بعد 5 أيام تحت الاهتزاز المداري (70 دورة في الدقيقة) ، يتم تشكيل كروي واحد لكل بئر. تقدم الأجسام الكروية المشكلة حجما وشكلا ثابتين ، وتتجنب هذه الطريقة تكوين كرويات متعددة في البئر ؛ وبالتالي ، ليس من الضروري اختيار كرويات ذات أحجام مماثلة. إن سهولة وسرعة وقابلية استنساخ هذه الطريقة الكروية تجعلها مفيدة للاختبارات عالية الإنتاجية في المختبر .
Introduction
الكرويات هي كرات صغيرة من الخلايا تتشكل عندما يتم استزراع الخلايا في اتصال وثيق من خلية إلى خلية في ثقافة 3D. تمت بالفعل دراسة قدرة الكائنات الكروية على تقليد بيئة الأنسجة في الجسم الحي في مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا والخلايا الأولية 1,2. ومع ذلك ، على الرغم من أن الكرويات متطورة بشكل جيد لدراسات سمية الثدييات ، إلا أن تطوير الكرويات لدراسات السمية مع الفقاريات غير الثديية (مثل الأسماك) لا يزال جاريا3. بالنسبة لخطوط خلايا الأسماك ، تم تطوير كرويات من خلال مجموعة متنوعة من الطرق المختلفة ، مثل الاهتزاز المداري (OS) باستخدام أنواع مختلفة من ألواح الآبار3،4،5،6،7 ، وطريقة الرفع المغناطيسي باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية8. ومع ذلك ، قد يكون لبعض طرق الاستزراع هذه للكرويات عيوب أكثر من غيرها.
على سبيل المثال ، قد تولد الطرق الدورانية في الألواح الدقيقة الكبيرة (24 صفيحة بئر) عددا كبيرا من الأجسام الكروية التي تختلف في الحجم والشكل ؛ في الواقع ، تم إثبات تكوين هيكل متعدد كروي7. وهذا يتطلب جهودا مكثفة لاختيار كرويات ذات حجم وشكل مماثلين للتجربة. تستخدم طريقة ثقافة 3D المعلقة بشكل شائع لتوليد كرويات من خطوط خلايا الثدييات1،2،9،10،11 ، حيث يمكن إنشاء كرويات مفردة لكل قطرة ، وتجنب المشاكل الموضحة أعلاه. ومع ذلك ، على الرغم من أن طريقة الإسقاط المعلقة المعدلة (قطرة معلقة + اهتزاز مداري) قادرة على توليد كرويات ZFL باستخدام طريقة غير مكلفة ، إلا أن لها عيوبها12. لا يمكن الحفاظ على المجاميع الخلوية المتكونة لفترات طويلة في القطرات. وبالتالي ، يجب نقلها إلى لوحات الآبار. تتطلب هذه العملية معالجة مكثفة وفترات طويلة من العمل في غطاء التدفق الصفحي ، حيث يتم تنفيذها بالتنقيط باستخدام micropipette12. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب هذه الطريقة 10 أيام لتشكيل كرويات ZFL بالكامل (5 أيام في قطرة معلقة + 5 أيام في نظام التشغيل)12. هذه العيوب يمكن أن تحد من تطبيق كرويات الأسماك 3D لاختبار السمية ، لا سيما بالنظر إلى التطبيقات المحتملة لتحديد الأولويات الكيميائية واستدامة المنتج.
وبالتالي ، تصف هذه المقالة بروتوكول ثقافة 3D قادر على توليد كرويات مفردة من خطوط خلايا ZFL (D. rerio normal hepatocyte) و ZEM2S (جنين مرحلة D. rerio blastula) بناء على الاستخدام المشترك ل 96 بئرا ، لوحات ربط منخفضة للغاية (لوحات ULA) وشاكر مداري (قطر دوران 22 مم). الطريقة المطبقة بسيطة وقابلة للتكرار ، ويمكن أن تولد أعدادا كبيرة من الأجسام الكروية ذات الحجم والشكل المماثل في فترة قصيرة (5 أيام). يمكن أن تدعم مزايا هذه الطريقة تطبيق نماذج الأسماك 3D لدراسات السمية المائية في كل من الصناعة والأوساط الأكاديمية ، وكذلك التقدم المحرز في تنفيذ طرق بديلة لاختبار السمية البيئية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه طريقة بسيطة وسهلة وسريعة لتوليد كرويات من كبد الزرد وخطوط خلايا الجنين. تم تطوير هذه الطريقة من قبل هذه المجموعة بناء على تعديلات الطرق الكروية ثلاثية الأبعاد الحالية للتغلب على المشكلات المبلغ عنها في الدراسات العلمية المتعلقة بتكوين كروي ، بالإضافة إلى عدم اليقين في دقة البيانات م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
في ذكرى الدكتور مارسيو لورينسيني ، مؤلف مشارك في هذا العمل ، باحث ممتاز في مجال مستحضرات التجميل ومكرس لتعزيز أبحاث التجميل في البرازيل. يعرب المؤلفون عن امتنانهم للمختبر متعدد المستخدمين في قسم علم وظائف الأعضاء (UFPR) لتوافر المعدات وللدعم المالي المقدم من التنسيق من أجل تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES ، البرازيل) (قانون المالية 001) و Grupo Boticário.
Materials
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids – A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022)
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
