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Ambiente

Zytotoxizitäts-Assays mit Zebrafisch-Zelllinien

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64860
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Dieses Protokoll enthält häufig verwendete Zytotoxizitätstests (Alamar Blue [AB], CFDA-AM-, Neutral Red- und MTT-Assays), die für die Bewertung der Zytotoxizität in Zebrafischembryo- (ZEM2S) und Leberzelllinien (ZFL) in 96-Well-Platten geeignet sind.

Abstract

Fischzelllinien werden zunehmend in Ökotoxizitätsstudien verwendet, und Zytotoxizitätstests wurden als Methoden zur Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen vorgeschlagen. Daher enthält dieses Protokoll Zytotoxizitätsassays, die modifiziert wurden, um die Zelllebensfähigkeit in Zebrafisch- (Danio rerio), Embryo- (ZEM2S) und Leber- (ZFL) Zelllinien in 96-Well-Platten zu bewerten. Die bewerteten Endpunkte der Zytotoxizität sind die mitochondriale Integrität (Alamar Blue [AB]- und MTT-Assays), die Membranintegrität über die Esteraseaktivität (CFDA-AM-Assay) und die lysosomale Membranintegrität (Neutral Red [NR]-Assay). Nach der Exposition der Testsubstanzen in einer 96-Well-Platte werden die Zytotoxizitätstests durchgeführt; Hier werden AB und CFDA-AM gleichzeitig durchgeführt, gefolgt von NR auf derselben Platte, während der MTT-Assay auf einer separaten Platte durchgeführt wird. Die Messwerte für diese Assays werden durch Fluoreszenz für AB und CFDA-AM und Absorption für MTT und NR ermittelt. Die mit diesen Fischzelllinien durchgeführten Zytotoxizitätstests können verwendet werden, um die akute Toxizität chemischer Substanzen an Fischen zu untersuchen.

Introduction

Chemische Stoffe müssen auf ihre Sicherheit für die menschliche Gesundheit und die Umwelt geprüft werden. Molekulare und zelluläre Biomarker werden zunehmend in Sicherheitsbewertungen zur Vorhersage von Auswirkungen auf lebende Organismen durch Regulierungsbehörden und/oder Gesetzgebungen (z. B. REACH, OECD, US-EPA)1,2 berücksichtigt, da sie dem unerwünschten In-vivo-Ergebnis (z. B. endokrine Störung, immunologische Reaktion, akute Toxizität, Phototoxizität) vorausgehen können3,4,5,6,7 . In diesem Zusammenhang wurde die Zytotoxizität als Maß für die Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen herangezogen 5,8; Es kann jedoch viele andere Anwendungen in Ökotoxizitätsstudien haben, wie z. B. die Definition subzytotoxischer Konzentrationen chemischer Substanzen, um ihre unterschiedlichsten Auswirkungen auf Fische zu untersuchen (z. B. endokrine Disruptoren).

In Zellkultursystemen (In-vitro-Systemen ) kann die Zytotoxizität chemischer Substanzen durch Methoden bestimmt werden, die sich in der Art der Endpunkte unterscheiden. Zum Beispiel kann eine Zytotoxizitätsmethode auf einem Endpunkt basieren, der sich auf die spezifische Morphologie bezieht, die während des Zelltodprozesses beobachtet wird, während eine andere die Zytotoxizität durch Messung des Zelltods, der Lebensfähigkeit und Funktionalität, der Morphologie, des Energiestoffwechsels sowie der Zellanhaftung und -proliferation bestimmen kann. Chemische Substanzen können die Zelllebensfähigkeit durch verschiedene Mechanismen beeinflussen, daher ist eine Bewertung der Zytotoxizität erforderlich, die verschiedene Endpunkte der Zelllebensfähigkeit abdeckt, um chemische Wirkungen vorherzusagen9.

MTT und Alamar Blue (AB) sind Assays, die die Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit auf der Grundlage der Zellstoffwechselaktivität bestimmen. Der MTT-Assay bewertet die Aktivität des mitochondrialen Enzyms Succinat-Dehydrogenase10. Die Reduktion von gelblichem 3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu Formazanblau tritt nur in lebensfähigen Zellen auf, und seine optische Dichte ist direkt proportional zur Anzahl lebensfähiger Zellen10. Der AB-Assay ist ein empfindlicher Oxidations-Reduktions-Indikator, der durch mitochondriale Enzyme vermittelt wird, die fluoreszieren und ihre Farbe ändern, wenn Resazurin von lebenden Zellen zu Resorufin reduziertwird 11; aber auch zytosolische und mikrosomale Enzyme tragen zur Reduktion von AB und MTT12 bei. Diese Enzyme können mehrere Reduktasen umfassen, wie z. B. Alkohol- und Aldehydoxidoreduktasen, NAD(P)H: Chinonoxidoreduktase, Flavinreduktase, NADH-Dehydrogenase und Cytochrome11.

Der Neutral Red (NR)-Assay ist ein Zellviabilitätstest, der auf dem Einbau dieses Farbstoffs in die Lysosomen lebensfähiger Zellenbasiert 13. Die Aufnahme von NR hängt von der Fähigkeit der Zellen ab, pH-Gradienten aufrechtzuerhalten. Der Protonengradient innerhalb der Lysosomen hält einen niedrigeren pH-Wert als das Zytoplasma aufrecht. Bei normalem physiologischen pH-Wert weist der NR eine Nettoladung von ungefähr Null auf, wodurch er die Zellmembranen durchdringen kann. Somit wird der Farbstoff geladen und bleibt in den Lysosomen zurück. Folglich ist die Anzahl der lebensfähigen Zellen14 umso größer, je größer die Menge an zurückgehaltenem NR ist. Chemische Substanzen, die die Zelloberfläche oder die lysosomalen Membranen schädigen, beeinträchtigen die Aufnahme dieses Farbstoffs.

Der CFDA-AM-Assay ist ein fluorometrischer Zellviabilitätstest, der auf der Retention von 5-Carboxyfluorescein-Diacetat-Acetoxymethylester (CFDA-AM)15 basiert. 5-CFDA-AM, ein Esterasesubstrat, wird in Carboxyfluorescein umgewandelt, eine fluoreszierende Substanz, die polar und durch Membranen lebender Zellen nicht durchlässig ist15; Somit wird es in der Innenseite einer intakten Zellmembran zurückgehalten, was auf lebensfähige Zellen hinweist.

Kürzlich wurden drei Zytotoxizitätstests (CFDA-AM-, NR- und AB-Assays) in einer validierten ISO-Richtlinie (International Organization for Standardization) (ISO 21115:2019)16 und einer OECD-Testmethode (OECD TG 249) kombiniert, um die akute Toxizität von Fischen unter Verwendung der RTgill-W1-Zelllinie (permanente Zelllinie aus der Kieme der Regenbogenforelle [Oncorhynchus mykiss]) in 24-Well-Plattenzu bewerten 17 . Obwohl es eine bestehende zellbasierte Methode zur Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen gibt, wurden Anstrengungen unternommen, um ähnliche Methoden mit anderen Fischarten zu entwickeln und den Durchsatz der Methode zu erhöhen. Einige Beispiele umfassen die Entwicklung von ZFL-Zelllinien, die mit Reportergenen für spezifische Toxizitätswege18,19 transfiziert wurden, Phototoxizitätstests in der RTgill-W1-Zelllinie 20 und die Verwendung von ZFL- und ZF4-Zelllinien (Zebrafisch-Fibroblasten, die aus 1 Tag alten Embryonen gewonnen wurden) zur Bewertung der Toxizität durch mehrere Zytotoxizitätstests21.

Danio rerio (Zebrafisch) ist eine der wichtigsten Fischarten, die in aquatischen Toxizitätsstudien verwendet werden. Daher können zellbasierte Methoden mit Zebrafisch-Zelllinien für die Toxizitätsprüfung von Fischen äußerst nützlich sein. Die ZFL-Zelllinie ist eine zebrafischepitheliale Hepatozytenzelllinie, die die Hauptmerkmale von Leberparenchymzellen aufweist und Xenobiotika 7,22,23,24,25 metabolisieren kann. Inzwischen ist die ZEM2S-Zelllinie eine embryonale Zebrafisch-Fibroblasten-Zelllinie, die aus dem Blastula-Stadium stammt und zur Untersuchung von Entwicklungseffekten auf Fische verwendet werden kann26,27. Daher beschreibt dieses Protokoll vier Zytotoxizitäts-Assays (MTT-, AB-, NR- und CFDA-AM-Assays), deren Modifikationen mit ZFL- und ZEM2S-Zelllinien in 96-Well-Platten durchgeführt werden müssen.

Protocol

ANMERKUNG: In der Materialtabelle finden Sie die Liste der in diesem Protokoll verwendeten Materialien und in Tabelle 1 die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen und Medien. 1. Vorbereitung von ZFL- und ZEM2S-Zellen Beginnen Sie mit einem T75-Kolben aus ZFL- oder ZEM2S-Zellen mit 80% Konfluenz, kultiviert im jeweiligen vollständigen Medium bei 28 °C ohne CO2. Nehmen Sie das Nährmedium a…

Representative Results

Abbildung 3 zeigt die Platten der AB-, CFDA-AM-, NR- und MTT-Assays. Für den AB-Assay (Abbildung 3A) zeigen die Blindvertiefungen und Vertiefungen ohne oder mit einer reduzierten Anzahl lebensfähiger Zellen eine blaue Farbe und eine geringe Fluoreszenz, während die Vertiefungen mit einer hohen Anzahl lebensfähiger Zellen rosa sind und aufgrund der Umwandlung von Resazurin (AB) in Resorufin (rosafarbene Substanz) durch die lebensfähigen Zellen hohe Fluoresze…

Discussion

Zytotoxizitätstests werden häufig für die In-vitro-Toxizitätsbewertung verwendet, und in diesem Protokollartikel werden vier häufig verwendete Zytotoxizitätstests vorgestellt, die für die Durchführung in Zebrafischzelllinien modifiziert wurden (d. h. Zelldichte für 96-Well-Platten, Inkubationszeit im MTT-Assay, FBS-Erschöpfung während der chemischen Expositionsbedingungen und maximal akzeptable Konzentration für die SC). Da diese Assays die Zytotoxizität anhand verschiedener Endpunkte der Zellleben…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

In Erinnerung an Dr. Márcio Lorencini, einen Mitautor dieser Arbeit, einen exzellenten Forscher auf dem Gebiet der Kosmetik, der sich der Förderung der kosmetischen Forschung in Brasilien verschrieben hat. Die Autoren danken dem Multi-User-Labor in der Abteilung für Physiologie (UFPR) für die Verfügbarkeit von Geräten und für die finanzielle Unterstützung der Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES, Brasilien) (Finanzcode 001) und der Grupo Boticario.

Materials

5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
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Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).
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