En klar til brug frosset bestand af neuroner er et kraftfuldt værktøj til evaluering af synaptiske funktioner. Her introducerer vi en let primærkultur med lav densitet fra frosset lager ved hjælp af en 96-brøndplade.
Neuronal kultur er et værdifuldt system til evaluering af synaptiske funktioner og lægemiddelscreeninger. Især tillader en lavdensitetskultur af primære hippocampale neuroner undersøgelsen af individuelle neuroner eller subcellulære komponenter. Vi har vist subcellulær proteinlokalisering i en neuron ved immunocytokemi, neuronal polaritet, synaptisk morfologi og dens udviklingsændring ved hjælp af en primær hippocampus kultur med lav densitet. For nylig er færdige frosne lagre af neuroner blevet kommercielt tilgængelige. Disse frosne lagre af neuroner reducerer den tid, der er nødvendig for at forberede dyreforsøg og bidrager også til reduktionen af antallet af anvendte dyr. Her introducerer vi en reproducerbar primærkulturmetode med lav densitet ved hjælp af en 96-brøndplade. Vi brugte en kommercielt tilgængelig frossen bestand af neuroner fra rottens embryonale hippocampus. Neuronerne kan dyrkes stabilt på lang sigt uden medieændringer ved at reducere væksten af gliaceller på bestemte tidspunkter. Denne analyse med høj kapacitet ved hjælp af kultur med lav densitet muliggør reproducerbare billeddannelsesbaserede evalueringer af synaptisk plasticitet.
Udviklingen af et in vitro eksperimentelt system, der kan vurdere synaptiske funktioner involveret i læring og hukommelse, er vigtig. Neuronal kultur er et værdifuldt system til evaluering af synaptiske funktioner in vitro. Den neuronale kulturteknik blev først brugt i 1980’erne, og i 1990’erne blev lavdensitetskultur af primære hippocampale neuroner udviklet 1,2,3 til undersøgelse af individuelle neuroner med hensyn til subcellulær lokalisering af proteinkomponenter, proteinhandel, neuronal polaritet, rygsøjlemorfologi, synapseudvikling og plasticitet 4,5,6,7,8 . Der er dog mange trin involveret i denne teknik: parring af dyr, dissekering af embryoner, forberedelse af dyrkningsbeholdere og dyrkning af celler i 3 uger med medieændringer en gang om ugen. Derudover kræver det avancerede teknikker3.
Vi har udviklet frosne bestande af dissocierede hippocampale neuroner fra rotteembryoner 9,10. De frosne lagre af neuroner er klar til brug, og der kræves ingen avancerede teknikker til dyrkning af cellerne11,12. Med andre ord afhænger dyrkning af neuronerne fra frosne lagre ikke af en eksperimentators teknik. Det eliminerer behovet for dyreforsøg (f.eks. tilladelse til dyreforsøg, arrangering af tidsbestemte drægtige dyr og dissekering af rotteembryoner) og reducerer dermed antallet af anvendte dyr. For nylig er højkvalitets, klar til brug frosne lagre af neuroner blevet kommercielt tilgængelige. Her brugte vi kommercielt tilgængelige frosne lagre fra fosterdagen (E) 18 rottehippocampus13,14,15. Dyrkning af neuronerne fra en frossen bestand kræver ikke glia-konditionerede medier eller co-kultur med gliaceller. Almindelige primære kulturmedier uden yderligere serum kan bruges til at dyrke cellerne; derfor kan vi erhverve reproducerbare data. Desuden er der ikke behov for medieudveksling i 3 uger efter cellesåningen, da væksten af gliaceller reduceres (figur 1).
Dendritiske rygsøjler er det postsynaptiske rum i de fleste excitatoriske synapser. De indeholder receptorproteiner, postsynaptiske stilladsproteiner og actin cytoskeletale proteiner. Vi fokuserede på et actinbindende protein drebrin 5,6,7,16,17,18. Drebrin akkumuleres ved rygsøjlehovedet i modne neuroner19, og vi rapporterede drebrin som markør for den synaptiske tilstand 15,17,20,21,22,23. Ved at udføre en analyse med højt indhold ved hjælp af drebrin som udlæsning har vi for nylig rapporteret de hæmmende virkninger af phencyclidinanaloger på N-methyl-D-asparaginsyre-glutamatreceptorer (NMDAR’er)10 og de NMDAR-afhængige virkninger af naturlige forbindelser og rå lægemidler på synaptiske tilstande15.
Her beskriver vi, hvordan man dyrker frosne lagre af neuroner ved lav densitet. Derudover viser vi en drebrin billeddannelsesbaseret evaluering af den synaptiske tilstand ved hjælp af 96-brøndplader.
Et kritisk trin i denne metode er at optø cellesuspensionen. Overførsel af cellesuspensionen, før den bliver for varm, er meget vigtig. For at undgå hurtig ændring af osmolalitet må du dog ikke overføre cellesuspensionen til et stort volumen af mediet på én gang. Dråbevis tilsætning af dyrkningsmediet er også afgørende for at undgå pludselige ændringer i osmotisk tryk.
Neuronerne kan dyrkes i andre kulturbeholdere: 24-brøndplader, 8-brøndkamre, 60 mm skåle eller MED-sonder. I disse tilfælde er det dog nødvendigt at justere den endelige koncentration og tidspunktet for tilsætning af Ara-C. Derudover skal tætheden af neuroner optimeres i forskellige typer eksperimenter. For eksempel kræves kultur med høj densitet til elektrofysiologiske eksperimenter, og i så fald er medieudvekslingen nødvendig to gange om ugen (figur 6). Således kræver en kultur med lav densitet færre trin end en kultur med høj densitet.
Neuronal kultur med lav densitet kræver ofte avancerede teknikker; Brug af klar til brug frosset lager løser imidlertid dette problem. Den beskrevne metode afhænger ikke af en eksperimentators dygtighed. Kvaliteten af frossen bestand er stabil og kan dyrkes stabilt, så længe de opbevares i flydende nitrogen og undgår temperaturændringer i op til 4 år.
Dyrkning af cellerne i 3 uger uden medium udveksling rejser spørgsmålet om, hvorvidt der er betydelige osmolalitetsændringer eller kulturmediefordampning. Vi har dog bekræftet, at fordampningen af kulturmedier er lille (reduktionsrate på 3,6%). Lokaliseringen af synaptiske proteiner og neuronernes morfologi forekommer normal efter 3 uger. Derfor forårsager 3-ugers kultur uden medieudveksling ikke store osmolalitetsændringer, der påvirker betingelserne for de dyrkede neuroner. At holde pladen i en inkubator efter Ara-C-behandling er også et vigtigt punkt, der minimerer fordampning.
Der er ingen begrænsning med hensyn til brugen af de frosne lagerneuroner. Der er dog nogle begrænsninger ved kulturmetoden med lav densitet. Vi bekræftede, at lavdensitetskulturen kunne anvendes til morfologisk observation af neuroner, evaluering af synaptisk funktion og GFP-transfektion. Vi har dog ikke undersøgt levende cellebilleddannelse. Derudover kræves der som nævnt ovenfor højdensitetskultur for at udføre elektrofysiologi.
Synapsemodning tager typisk 3 uger7, og vi kan ikke bekræfte, at de dyrkede neuroner har ordentlige synapser indtil slutningen. Hvis synapsemodningen ikke er god efter 3 uger, bliver vi nødt til at dyrke igen. Ved at kende kvaliteten af neuronerne, inden vi starter eksperimenterne, kan vi redde disse 3 uger. For at udføre eksperimenter effektivt er det derfor bedst at kontrollere kvaliteten af neuronerne på forhånd. Frosne lagre gør det muligt at kontrollere kvaliteten af neuronerne på forhånd. Hvert parti frosne lagre genereres fra et kuld rotter, og vi kan bruge en af lagrene fra hvert parti til en kvalitetskontrol. Drebrin er en god markør for kvalitetskontrol af neuronerne. Som beskrevet akkumuleres drebrin i rygsøjlehovedet i modne neuroner, og det reagerer på synaptisk stimulering. Således kan vi kontrollere kvaliteten af neuronerne i frosne lagre ved at bruge drebrin som markør.
Denne metode kan anvendes til at evaluere virkningen af lægemidler på den synaptiske tilstand. Drebrin exodus fra dendritiske rygsøjler forekommer i de indledende faser af synaptisk plasticitet22. Derfor viser påvisningen af reduktion af drebrinklynge fremkaldt ved lægemiddelbehandling, at lægemidlet stimulerer synapsen og forårsager synaptisk plasticitet. For at identificere, om reduktionen er NMDAR-afhængig, er et eksperiment med 2-amino-5-phosphonovalersyre (APV, en NMDAR-antagonist) nyttigt. Ved hjælp af drebrin som markør bestemmes selv en NMDAR-afhængighed klart10,15. Den beskrevne metode er nyttig i lægemiddelscreeninger, sikkerhedsfarmakologiske undersøgelser og evaluering af synaptisk funktion.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Kazumi Kamiyama og Manami Kawada for hjælp med eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI (bevillingsnummer 19K08010 til N.K.) og Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (bevillingsnummer JP19bk0104077 og JP22bm0804024 til T.S.).
96 well plate | Zeon Corporation | Gifted | |
96 well plate | greiner | 655986 | |
Anti-drebrin antibody (M2F6) | MBL | D029-3 | Mouse monoclonal (dilution 1:1) |
Anti-MAP2 antibody | Millipore | AB5622 | Rabbit (dilution 1:1000) |
Anti-mouse Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | Dilution 1: 500 |
Anti-rabbit Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | Dilution 1: 500 |
B-27 | Gibco | 17504-044 | 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates |
Borax | Sigma | B-9876 | Final concentration 12 mM |
Boric acid | WAKO | 021-02195 | Final concentration 50 mM |
Bovine serum albumin | Millipore | 12659-100G | Final concentration: 3% in PBS |
Confocal quantitative image cytometer CellVoyager CQ1 |
YOKOGAWA | Phase contrast images | |
Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) | Sigma | C-6645 | Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM) |
DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | Dilution 1:1000 |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates |
In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | Fluorescence images | |
Laminin | Sigma | 114956-81-9 | Final concentration: 20 µg/mL |
Maestro | Axion Biosystems | MEA recordings | |
MEA plate | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Paraformaldehyde | nacalai tesque | 26126-25 | Final concentration: 4% in PBS |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL for normal plates |
Penicillin/Streptomycin | nacalai tesque | 26253-84 | 100 µg/mL for MEA plates |
polyethyleimine | Sigma | 9002-98-6 | Final concentration: 0.1% |
Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL) |
SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 x 106 cells/tube |
Sodium azide | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
SodiumL(+)-Glutamate monohydrate | WAKO | 194-02032 | Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM) |