קביעת אימונוגניות החיסון באמצעות תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר

Summary

המתודולוגיה מתארת את הייצור של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר (MoDCs) ואת יישומם להערכה חוץ גופית של מועמדים אנטיגניים במהלך הפיתוח של חיסונים וטרינריים פוטנציאליים בבקר.

Abstract

תאים דנדריטיים (DCs) הם התאים מציגי האנטיגן (APC) החזקים ביותר במערכת החיסון. הם מסיירים באורגניזם בחיפוש אחר פתוגנים וממלאים תפקיד ייחודי במערכת החיסון על ידי קישור בין תגובות החיסון המולדות והנרכשות. תאים אלה יכולים לבצע פגוציטים ולאחר מכן להציג אנטיגנים שנלכדו לתאי מערכת החיסון המשפיעים, מה שמעורר מגוון רחב של תגובות חיסוניות. מאמר זה מדגים שיטה סטנדרטית לייצור במבחנה של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר (MoDCs) שבודדו מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים של בקר (PBMCs) ויישומם בהערכת אימונוגניות חיסונים.

מיון תאים מבוסס מגנטית שימש לבידוד מונוציטים CD14+ מ– PBMCs, ותוספת של מדיום תרבית שלם עם אינטרלוקין (IL)-4 וגורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) שימשה כדי לגרום להתמיינות של מונוציטים CD14⁺ ל- MoDCs נאיביים. הדור של MoDCs לא בשלים אושר על ידי זיהוי הביטוי של קומפלקס היסטותאימות גדול II (MHC II), CD86 ו- CD40 פני השטח של התא. חיסון כלבת זמין מסחרית שימש כדי לפעום את MoDCs לא בשלים, אשר לאחר מכן תורבתו יחד עם לימפוציטים נאיביים.

ניתוח ציטומטריית הזרימה של MoDCs פועמים אנטיגן ותרבית לימפוציטים משותפת חשף את הגירוי של התפשטות לימפוציטים מסוג T באמצעות ביטוי של סמני Ki-67, CD25, CD4 ו- CD8. ניתוח ביטוי ה-mRNA של IFN-γ ו-Ki-67, תוך שימוש ב-PCR כמותי, הראה כי ה-MoDCs יכולים לגרום לפרימה ספציפית לאנטיגן של לימפוציטים במערכת זו של תרבית משותפת במבחנה . יתר על כן, הפרשת IFN-γ שהוערכה באמצעות ELISA הראתה טיטר גבוה משמעותית (**p < 0.01) בתרבית הלימפוציטים MoDC-לימפוציטים פועמת חיסון כלבת מאשר בתרבית לימפוציטים MoDC-לימפוציטים ללא אנטיגן. תוצאות אלה מראות את התוקף של בדיקת MoDC במבחנה זו למדידת אימונוגניות חיסונים, כלומר ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לזהות מועמדים פוטנציאליים לחיסון בקר לפני שתמשיך בניסויי in vivo , כמו גם בהערכות אימונוגניות חיסונים של חיסונים מסחריים.

Introduction

חיסון וטרינרי מייצג היבט מכריע של גידול בעלי חיים ובריאותם, שכן הוא תורם לשיפור הביטחון התזונתי ורווחת בעלי החיים על ידי הענקת הגנה מפני מחלות המשפיעות על משק החי ברחבי העולם¹. שיטה יעילה במבחנה להערכת האימונוגניות של מועמדים אפשריים לחיסון תסייע להאיץ את תהליך הפיתוח והייצור של חיסונים. לכן, יש צורך להרחיב את תחום בדיקות החיסון עם מתודולוגיות חדשניות המבוססות על מחקרי מבחנה , שכן זה יעזור לחשוף את המורכבות של תהליכים חיסוניים הקשורים חיסון זיהום פתוגן. כיום, מחקרי חיסון ואתגר של בעלי חיים in vivo , הדורשים דגימה תקופתית (למשל, דם וטחול), משמשים למדידת האימונוגניות של חיסונים ואדג’ובנטים מועמדים. בדיקות אלה יקרות, גוזלות זמן ויש להן השלכות אתיות, מכיוון שברוב המקרים, המתת חסד של בעלי חיים מתבצעת עד סוף הניסויים.

כחלופה למבחני in vivo, תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) שימשו להערכת תגובות חיסוניות המושרות על ידי חיסונים במבחנה². PBMCs הם אוכלוסייה הטרוגנית של תאים המורכבת מ 70%-90% לימפוציטים, 10%-20% מונוציטים, ומספר מוגבל של תאים דנדריטיים (DCs, 1%-2%)³. PBMCs מכילים תאים מציגי אנטיגן (APC) כגון תאי B, מונוציטים ו-DC, אשר מסיירים ללא הרף באורגניזם בחיפוש אחר סימני זיהום או נזק לרקמות. כימוקינים המופרשים באופן מקומי מאפשרים גיוס והפעלה של נגמ”שים לאתרים אלה על ידי קשירה לקולטני פני השטח של התא. במקרה של מונוציטים, כימוקינים מכוונים את גורלם להתמיין ל-DCs או למקרופאגים⁴. ברגע ש-DCs נתקלים בפתוגן ולוכדים אותו, הם נודדים לאיברי לימפה משניים, שם הם יכולים להציג את האנטיגנים הפפטידיים המעובדים של הפתוגן באמצעות חלבוני שטח מסוג I או Class II של קומפלקס היסטותאימות עיקריים (MHC) לתאי CD8+ T או CD4⁺ T, בהתאמה, ובכך לעורר תגובה חיסונית ^5,6.

תפקיד המפתח שממלאים DCs בתיאום תגובה חיסונית מגנה מפני פתוגנים שונים הופך אותם ליעד מחקרי מעניין להבנת מנגנוני חיסון תוך-תאיים, במיוחד בעת תכנון חיסונים ואדג’ובנטים נגד גורמים זיהומיים⁷. מכיוון שחלק ה- DCs שניתן להשיג מ- PBMCs הוא קטן למדי (1%-2%), מונוציטים שימשו במקום זאת ליצירת DCs במבחנה⁸. DCs אלה שמקורם במונוציטים (MoDCs) פותחו בתחילה כאסטרטגיית טיפול אפשרית באימונותרפיה לסרטן⁹. לאחרונה, MoDCs שימשו למחקר חיסונים 10,11,12^, ומונוציטים קלאסיים הם תת-הסוג הדומיננטי (89%) לייצור MoDC ¹³. הייצור של MoDCs במבחנה הושג בעבר באמצעות תוספת של גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) שניתן בשילוב עם ציטוקינים אחרים כגון אינטרלוקין-4 (IL-4), גורם נמק הגידול α (TNF-α), או IL-13^14,15,16.

ההצלחה של בדיקת MoDC במבחנה מסתמכת על היכולת של MoDCs בוגרים מעוררי אנטיגן לווסת את ההיקף והסוג של התגובה החיסונית הספציפית לסוג האנטיגן שזוהה¹⁷. סוג הפתוגן המוכר ומוצג על ידי MoDCs קובע את ההתמיינות של תאי CD4⁺ T עוזר (Th) לתאי השפעה Th1, Th2 או Th17 ומאופיין בפרופיל ציטוקין מפריש ספציפי לפתוגן. תגובת Th1 מופעלת נגד פתוגנים תוך-תאיים וגורמת להפרשת אינטרפרון-גמא (IFN-γ) וגורם נמק הגידול בטא (TNF-β), המווסת הגנה תלוית פגוציטים. תגובת Th2 מופעלת נגד אורגניזמים טפיליים ומאופיינת בהפרשת IL-4, IL-5, IL-10 ו-IL-13, היוזמת הגנה הומורלית בלתי תלויה בפאגוציטים. Th17 מציע הגנה תלוית נויטרופילים מפני זיהומים חיידקיים ופטריות חוץ-תאיים בתיווך הפרשת IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 ו-TNF-α 18,19,20,21. בהתבסס על מחקרים קודמים, צוין כי לא כל הפתוגנים נופלים בפרופיל הציטוקינים הצפוי. לדוגמה, MoDCs עוריים, בתגובה לזיהום טפילי לישמניה, מעוררים הפרשת IFN-γ מתאי T CD4+ ותאי T CD8⁺, ובכך גורמים לתגובת Th1 פרו-דלקתית מגנה²².

כמו כן, הוכח כי בעופות MoDCs עם סלמונלה ליפופוליסכריד (LPS), יכול לגרום לתגובה משתנה נגד סלמונלה טיפימוריום על ידי הפעלת תגובות Th1 ו- Th2, בעוד סלמונלה גלינרום גורם לתגובת Th2 בלבד, מה שיכול להסביר את ההתנגדות הגבוהה יותר של האחרון לקראת אישור MoDC²³. ההפעלה של MoDCs נגד Brucella canis (B. canis) דווחה גם בכלבים ובבני אדם, כלומר זה יכול לייצג מנגנון זיהום זואונוטי²⁴. MoDCs אנושיים עם B. canis גורמים לתגובת Th1 חזקה המקנה עמידות לזיהום חמור, בעוד ש-MoDCs לכלבים גורמים לתגובת Th17 דומיננטית עם תגובת Th1 מופחתת, מה שמוביל לאחר מכן לביסוס זיהום כרוני²⁵. MoDCs של בקר מראים זיקה מוגברת לווירוס מחלת הפה והטלפיים (FMDV) מצומד לאימונוגלובולין G (IgG) בהשוואה ל- FMDV לא מצומד בלבד, שכן MoDCs יוצרים קומפלקס נוגדנים נגיפי בתגובה ל-¹⁰ הראשונים. יחד, מחקרים אלה מראים כיצד נעשה שימוש ב-MoDCs כדי לנתח את המורכבות של תגובות חיסוניות במהלך זיהום פתוגן. ניתן להעריך את התגובה החיסונית הנרכשת על ידי כימות של סמנים ספציפיים הקשורים לשגשוג לימפוציטים. Ki-67, חלבון תוך-תאי המזוהה רק בתאים מתחלקים, נחשב לסמן אמין למחקרי התפשטות²⁶, ובאופן דומה, CD25 המתבטא על פני השטח של תאי T בשלב המאוחר של ההפעלה מתאים להתרבות לימפוציטים^27,28.

מחקר זה מדגים שיטה מתוקננת לייצור במבחנה של MoDCs בקר, ולאחר מכן יישומם בבדיקת חיסון חוץ גופית המשמשת לבדיקת האימונוגניות של חיסונים. חיסון כלבת זמין מסחרית (RV) שימש כדי לאמת את היעילות של בדיקה זו. הפעלה והתפשטות של לימפוציטים מסוג T נמדדו על ידי ציטומטריית זרימה, תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז (qPCR) ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) באמצעות ניתוח של סמני הפעלת תאים מבוססים היטב כגון Ki-67 ו- CD25 והפרשת IFN-γ 28,29,30,31. במהלך הניסוי של משרד ההגנה לא נערכו ניסויים בבעלי חיים או בבני אדם.

Protocol

איסוף הדם מתבצע על ידי שירות וטרינר מוסמך בהתאם להנחיות האתיות של הסוכנות האוסטרית לבריאות ובטיחות מזון (AGES) ובהתאם לתקנים המקובלים לרווחת בעלי חיים32. המחקר קיבל אישור אתי ממשרד החקלאות האוסטרי. התכנון הניסיוני ליצירת MoDCs ויישומו לאחר מכן מומחש באיור 1. <p class…

Representative Results

מתודולוגיה זו מתארת את הדור במבחנה של MoDCs בקר להערכת אנטיגנים מועמדים לחיסון לפני ביצוע מחקרי in vivo. איור 1 מדגים את התוכנית הניסיונית של יצירת MoDC בקר ואת היישום של MoDCs עבור בדיקות במבחנה. באמצעות טכניקת מיון תאים מבוססת מגנטיות, ניתן היה לאסוף כ -26 מיליון מיוצי?…

Discussion

מחקר זה מדגים שיטה מתוקננת במבחנה לייצור ופנוטיפ של MoDC בקר והשימוש בהם לאחר מכן במדידת האימונוגניות של החיסון של חיסון מסחרי (למשל, RV). MoDCs של בקר יכולים לשמש ככלי לסינון אנטיגנים פוטנציאליים של חיסונים נגד מחלות בקר וחיזוי ההשפעה הקלינית הפוטנציאלית שלהם בהתבסס על תגובות חיסוניות לפ?…

Materials

ACK Lysing Buffer	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit	Bio-Rad, UK	PBP015KZZ	Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody	Bio-Rad	MCA2678F	Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA2430PE	Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody	Bio-Rad	MCA1653A647	Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA2431F	Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody	Bio-Rad	MCA837F	Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA2437PE	Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	–	Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube	Falcon Corning	352096 & 352070	15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences	555028	Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol	Sigma Aldrich	1009832500	Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher	10500064	Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS	GE Health care Life Sciences, USA	341691	Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent	Beckman Coulter, Life Sciences	A64669	500 mL
FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA	–	Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube	Falcon Corning	352235	5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran	Sigma Aldrich, Germany	60842-46-8	FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer	Beckman Coulter	–	Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	HSP9601	96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads	Miltenyi Bioteck, Germany	130-050-201	2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza	Beckman Coulter, Germany	–	Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column	Miltenyi Bioteck, Germany	130-042-401	Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody	Bio-Rad	MCA2228F	Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube	Sigma Aldrich	HS4325	1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point	Microsoft	–	The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA928F	Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD86 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD25 monoclonal antibody
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody	Bio-Rad	MCA929F	Isotype control for MHC class II monoclonal antibody
Nobivac Rabies	MSD Animal Health, UK	–	1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals	Bi0-Rad	TCS0803	0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7.4, 1x concentration
Prism – GraphPad 5 Software	Dotmatics	–	Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody	Biolegend, USA	350501	Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody	Biolegend	400101	Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide	BD Bio Sciences	1351101	Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein	R&D System, USA	202-IL-010/CF	Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium	Sigma Aldrich	R8758	Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art	Les Laboratories Servier	–	Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen, Thermo Fisher	18080051	Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24	TPP, Switzerland	92024	24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen, Thermo Fisher	10977023	0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes	Thermo Fisher Scientific	15206067	VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water	Sigma Aldrich	W3500-1L	Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture