Простой протокол для картирования черт архитектуры корневой системы растений
Summary
Мы используем простые лабораторные инструменты для изучения архитектуры корневой системы (RSA) Arabidopsis и Medicago. Ростки выращивают на гидропонике над сеткой и распределяют с помощью художественной кисти, чтобы выявить RSA. Изображения делаются с помощью сканирования или камеры с высоким разрешением, а затем анализируются с помощью ImageJ для отображения черт.
Abstract
Всесторонние знания о развитии архитектуры корневой системы растений (RSA) имеют решающее значение для повышения эффективности использования питательных веществ и повышения устойчивости сортов сельскохозяйственных культур к экологическим проблемам. Представлен экспериментальный протокол для настройки гидропонной системы, роста ростков, распространения RSA и визуализации. В подходе использовалась пурпурная коробчатая гидропонная система, содержащая полипропиленовую сетку, поддерживаемую поликарбонатными клиньями. Экспериментальные условия иллюстрируются оценкой RSA проростков при различном поступлении питательных веществ (фосфатов [Pi]). Система была создана для изучения RSA Arabidopsis, но ее легко адаптировать для изучения других растений, таких как Medicago sativa (люцерна ). Проростки Arabidopsis thaliana (Col-0) используются в этом исследовании в качестве примера для понимания растения RSA. Семена стерилизуют путем обработки этанолом и разбавленным коммерческим отбеливателем и выдерживают при температуре 4 ° C для стратификации. Семена проращивают и выращивают на жидкой полуМС среде на полипропиленовой сетке, поддерживаемой поликарбонатными клиньями. Ростки выращивают в стандартных условиях роста в течение желаемого количества дней, аккуратно вынимают из сетки и погружают в водосодержащие агаровые пластины. Каждая корневая система ростков аккуратно выкладывается на заполненную водой тарелку с помощью круглой художественной кисти. Эти пластины Петри фотографируются или сканируются с высоким разрешением, чтобы задокументировать признаки RSA. Корневые признаки, такие как первичный корень, боковые корни и зона ветвления, измеряются с помощью свободно доступного программного обеспечения ImageJ. В этом исследовании представлены методы измерения характеристик корней растений в контролируемых условиях окружающей среды. Мы обсудим, как (1) выращивать ростки, собирать и распространять образцы корней, (2) получать изображения распространенных образцов RSA, (3) захватывать изображения и (4) использовать программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки корневых атрибутов. Преимущество настоящего метода заключается в универсальном, простом и эффективном измерении признаков RSA.
Introduction
Архитектура корневой системы (RSA), находящаяся под землей, является жизненно важным органом для роста и продуктивности растений 1,2,3. После эмбриональной стадии растения претерпевают наиболее значительные морфологические изменения. То, как корни растут в почве, сильно влияет на рост частей растений над землей. Рост корней является первым шагом в прорастании. Это информативная черта, поскольку она однозначно реагирует на различные доступные питательные вещества 1,2,3,4. RSA демонстрирует высокую степень пластичности развития, что означает, что окружающая среда всегда используется для принятия решений о развитии 2,5. Изменения в окружающей среде затруднили производство сельскохозяйственных культур в нынешнем сценарии. На постоянной основе ЮАР учитывает сигналы окружающей среды при выборе вариантов развития5. В результате глубокое понимание принципов, лежащих в основе развития корней, имеет важное значение для изучения того, как растения реагируют на изменение окружающей среды 2,5.
RSA определяет различные концентрации питательных веществ и вносит фенотипические изменения 4,6,7,8,9,10,11,12. Исследования показывают, что морфология корня / RSA очень пластична по сравнению с морфологией побегов 1,3. Картирование признаков RSA очень эффективно при регистрации эффекта изменения окружающей почвенной среды 1,11,12.
В целом, расхождения во влиянии различных дефицитов питательных веществ на фенотип корня были зарегистрированы во многих более ранних исследованиях 3,11,13,14,15. Например, есть несколько противоположных сообщений об изменениях количества, длины и плотности боковых корней (LR), вызванных фосфатным голоданием (Pi). Сообщалось об увеличении плотности LR при условии дефицита Pi 6,8. Напротив, снижение плотности LR в условиях дефицита Pi также было сообщено другими авторами 3,13,16. Одной из основных причин этих несоответствий является использование подверженной элементарному загрязнению желирующей среды, которую агар часто содержит10. Исследователи обычно выращивают свои экспериментальные растения на пластинчатой системе на основе агара и записывают корневые признаки. Многочисленные признаки RSA часто скрыты или укоренены в агаровом материале и не могут быть задокументированы. Эксперименты, связанные с индуцированием дефицита питательных веществ, в которых пользователи часто полностью исключают один компонент из среды, не могут быть выполнены в подверженной элементарному загрязнению желирующей среде11,14,15. Многочисленные питательные вещества часто присутствуют в значительных количествах в агаровой среде, включая P, Zn, Fe и многие другие11,14,15. Кроме того, рост RSA медленнее в средах на основе агара, чем в жидкой среде без агара. В результате возникает необходимость в разработке альтернативного неагарового подхода для количественной оценки и качественной регистрации фенотипа RSA. Следовательно, был разработан текущий метод, в котором ростки выращиваются в пурпурной коробчатой гидропонной системе поверх полипропиленовой сетки, поддерживаемой поликарбонатными клиньями 1,10,11.
В этом исследовании представлена подробная импровизированная версия более раннего метода, описанного Jain et al.10. Эта стратегия была адаптирована к текущим требованиям биологии корней растений и может также использоваться для таких растений, как люцерна, кроме модельных растений. Протокол является основным способом измерения изменений в RSA, и для него требуется только простое оборудование. Настоящий протокол иллюстрирует, как фенотипировать несколько корневых признаков, таких как первичные и боковые корни в нормальной и модифицированной среде (дефицит Pi). Пошаговые инструкции и другие полезные советы, почерпнутые из опыта автора, предоставляются, чтобы помочь исследователям следовать методологиям, предлагаемым в этом методе. Настоящее исследование направлено на то, чтобы предоставить простой и эффективный метод выявления всей корневой системы растений, включая LR высшего порядка. Этот метод включает в себя ручное разведение корневой системы круглой акварельной художественной кистью, позволяющей точно контролировать обнажение корней 1,10,11,12. Он не требует дорогостоящего оборудования или сложного программного обеспечения. Этот метод улучшил усвоение питательных веществ и скорость роста; Растения имеют богатый питательными веществами раствор, легко поглощаемый их корнями. Настоящий метод подходит для исследователей, которые хотят детально отобразить черты корневой системы растения, особенно на ранних стадиях развития (через 10-15 дней после прорастания). Он подходит для небольших корневых систем, модельных растений, таких как арабидопсис и табак, и нетрадиционных растений, таких как люцерна, пока их корневая система не поместится в пурпурные коробочки.
Этапы фенотипического анализа развития RSA у Arabidopsis изложены в этом протоколе следующим образом: (1) метод стерилизации поверхности семян для растений (Arabidopsis), (2) этапы создания гидропонной системы с последующим посевом семян на среду, (3) процедура извлечения полных семян и разбрасывания на пластине Петри для анализа RSA, (4) как записывать изображения для RSA, и (5) вычислять важные параметры RSA с помощью программного обеспечения ImageJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа продемонстрировала картографирование RSA с использованием простого лабораторного оборудования. С помощью этого метода регистрируются фенотипические изменения на уточненном уровне. Преимущество этой стратегии заключается в том, что часть побегов никогда не соприкасается с…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем благодарность Министерству сельского хозяйства США (грант 58-6406-1-017) за поддержку этого исследования. Мы также выражаем признательность Биотехнологическому центру WKU, Университету Западного Кентукки, Боулинг-Грин, штат Кентукки, США, и директору Центрального института лекарственных и ароматических растений CSIR, Лакхнау, Индия, за предоставление инструментального оборудования и поддержки (рукописное сообщение CSIR CIMAP No CIMAP/PUB/2022/103). SS признает финансовую поддержку со стороны Университета Святого Иосифа, Филадельфия, США.
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
Referências
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. . National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
