用于映射植物根系架构特征的简单协议
Summary
我们使用简单的实验室工具来检查拟南芥和Medicago的根系结构（RSA）。将小苗水培生长在网眼上，并使用艺术刷展开以露出RSA。使用扫描或高分辨率相机拍摄图像，然后使用ImageJ进行分析以映射特征。
Abstract
全面了解植物根系结构（RSA）的发展对于提高养分利用效率和提高作物品种对环境挑战的耐受性至关重要。提出了用于建立水培系统，幼苗生长，RSA传播和成像的实验方案。该方法使用基于洋红色箱的水培系统，其中包含由聚碳酸酯楔块支撑的聚丙烯网。实验设置通过评估不同营养（磷酸盐[Pi]）供应下幼苗的RSA来举例说明。该系统的建立是为了检查拟南芥的RSA，但它很容易适应研究其他植物，如 Medicago sativa （苜蓿）。拟 南芥 （Col-0）幼苗在本次调查中用作了解植物RSA的示例。通过处理乙醇和稀释的商业漂白剂对种子进行表面灭菌，并保持在4°C进行分层。种子在由聚碳酸酯楔块支撑的聚丙烯网上的液体半MS培养基上发芽并生长。将幼苗在标准生长条件下生长所需的天数，从网中轻轻挑出，并浸没在含水的琼脂平板中。在圆形艺术刷的帮助下，将小苗的每个根系轻轻地铺在充满水的盘子上。这些培养皿以高分辨率拍照或扫描以记录RSA性状。根性状，如主根、侧根和分支区，使用免费提供的 ImageJ 软件进行测量。本研究提供了在受控环境环境中测量植物根系特征的技术。我们讨论了如何（1）种植幼苗，收集和传播根样本，（2）获得传播RSA样本的图片，（3）捕获图像，以及（4）使用图像分析软件量化根属性。该方法的优点是可以通用、简单、有效地测量RSA性状。
Introduction
地下的根系结构（RSA）是植物生长和生产力的重要器官1，2，3。在胚胎阶段之后，植物经历了最显着的形态变化。根在土壤中的生长方式极大地影响了地面上植物部分的生长。根系生长是发芽的第一步。这是一个信息性状，因为它对不同的可用营养素做出独特的反应1，2，3，4。RSA表现出高度的发展可塑性，这意味着环境总是被用来做出有关发展的决策2，5。在目前的情况下，环境的变化使作物生产更加困难。RSA持续地将环境信号纳入发展选择5。因此，彻底了解根系发育背后的原理对于了解植物如何应对不断变化的环境至关重要2，5。
RSA感知不同的营养浓度，并呈现表型改变4，6，7，8，9，10，11，12。研究表明，与枝条形态相比，根形态/RSA 具有高度可塑性1，3。RSA性状映射在记录周围土壤环境变化的影响方面非常有效1，11，12。
一般来说，在许多早期研究中已经报道了各种营养缺乏对根表型的影响的差异3，11，13，14，15。例如，有几个关于磷酸盐 （Pi） 饥饿引起的侧根 （LR） 数量、长度和密度变化的对比报告。据报道，在 Pi 缺陷条件下6，8 下 LR 密度增加。相比之下，其他作者也报告了在Pi缺陷条件下LR密度的降低3，13，16。这些不一致的主要原因之一是使用了容易发生元素污染的胶凝培养基，琼脂通常含有10种。研究人员通常在基于琼脂的平板系统上种植实验植物并记录根性状。许多RSA性状经常隐藏或根深蒂固地存在于琼脂材料中，无法记录。与诱导营养缺乏相关的实验，其中使用者经常从培养基中完全排除一种成分，不能在容易发生元素污染的胶凝培养基中进行11，14，15。琼脂培养基中经常大量存在许多营养素，包括P，Zn，Fe以及更多11，14，15。此外，RSA在琼脂基培养基中的生长速度低于非琼脂基液体培养基。因此，有必要建立一种替代的非琼脂方法，用于定量和定性记录RSA的表型。因此，已经开发了目前的方法，其中幼苗在基于洋红色盒的水培系统中生长，该系统位于由聚碳酸酯楔块1，10，11支撑的聚丙烯网之上。
这项研究提出了Jain等人描述的早期方法的详细即兴版本10。该策略已针对植物根系生物学的当前需求进行了调整，也可用于除模式植物以外的苜蓿等植物。该协议是测量 RSA 变化的主要方法，它只需要简单的设备。本协议说明了如何表型几种根特征，例如正常和修饰培养基（Pi缺陷）中的主根和侧根。提供了从作者的经验中收集的分步说明和其他有用的提示，以帮助研究人员遵循该方法中提供的方法。本研究旨在提供一种简单有效的方法来揭示植物的整个根系，包括高阶LRs。这种方法涉及用圆形水彩艺术刷手动涂抹根系，从而可以精确控制根部的曝光1，10，11，12。它不需要昂贵的设备或复杂的软件。这种方法提高了养分吸收和生长速度;植物具有易于被根部吸收的营养丰富的溶液。本方法适用于希望详细绘制植物根系特征的研究人员，特别是在早期发育期间（发芽后10-15天）。它适用于小根系、拟南芥和烟草等模式植物，以及苜蓿等非传统植物，直到它们的根系适合洋红色盒子。
该协议概述了拟南芥中RSA发育的表型分析步骤如下：（1）植物种子表面灭菌的方法（拟南芥），（2）建立水培系统的步骤，然后在培养基上播种，（3）取出完整种子并在培养皿上铺展以进行RSA分析的程序， （4）如何记录RSA的图像，以及（5）使用ImageJ软件计算重要的RSA参数。
Protocol
Representative Results
Discussion
这项工作演示了使用简单的实验室设备绘制RSA的地图。使用这种方法，在精细水平上记录表型改变。这种策略的好处是芽部永远不会与培养基接触，因此小苗的表型是原始的。该方法涉及建立水培系统以按照协议中所述种植幼苗。然后，将每个幼苗完整取出并放置在充满琼脂的培养皿上。然后允许使用艺术刷手动涂抹根系，并拍摄照片以使用ImageJ软件1，10，<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢美国农业部（拨款58-6406-1-017）支持这项研究。我们还要感谢位于美国肯塔基州鲍灵格林的西肯塔基大学温肯生物技术中心和印度勒克瑙CSIR中央药用和芳香植物研究所所长提供仪器设施和支持（CSIR CIMAP手稿通信编号CIMAP/PUB/2022/103）。SS感谢美国费城圣约瑟夫大学的财政支持。
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
Referências
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