פרוטוקול פשוט למיפוי תכונות ארכיטקטורת מערכת שורש הצמח
Summary
אנו משתמשים בכלי מעבדה פשוטים כדי לבחון את ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA) של Arabidopsis ו- Medicago. העציצים גדלים באופן הידרופוני על גבי רשת ומפוזרים באמצעות מברשת אמנותית כדי לחשוף את ה-RSA. התמונות מצולמות באמצעות סריקה או מצלמה ברזולוציה גבוהה, ולאחר מכן מנותחות באמצעות ImageJ כדי למפות תכונות.
Abstract
ידע מקיף בפיתוח ארכיטקטורת מערכת שורשי צמחים (RSA) הוא קריטי לשיפור יעילות השימוש בחומרים מזינים ולהגברת סבילות זני היבול לאתגרים סביבתיים. פרוטוקול ניסויי מוצג להקמת המערכת ההידרופונית, גידול צמחים, התפשטות RSA והדמיה. הגישה השתמשה במערכת הידרופונית מבוססת קופסת מגנטה המכילה רשת פוליפרופילן הנתמכת על ידי טריזי פוליקרבונט. הגדרות ניסוי מודגמות על ידי הערכת RSA של הצמחים תחת אספקת חומרים מזינים משתנים (פוספט [Pi]). המערכת הוקמה כדי לבחון את RSA של Arabidopsis, אבל זה בקלות להסתגל לחקור צמחים אחרים כמו Medicago sativa (אספסת). צמחי Arabidopsis thaliana (Col-0) משמשים במחקר זה כדוגמה להבנת הצמח RSA. זרעים מעוקרים על פני השטח על ידי טיפול באתנול ואקונומיקה מסחרית מדוללת, ונשמרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לריבוד. הזרעים מונבטים וגדלים על מדיום נוזלי של חצי MS על רשת פוליפרופילן הנתמכת על ידי טריזי פוליקרבונט. העציצים גדלים בתנאי גידול סטנדרטיים למספר הימים הרצוי, נקטפים בעדינות מהרשת ושקועים בצלחות אגר המכילות מים. כל מערכת שורשים של הצמחים נפרסת בעדינות על צלחת מלאה במים בעזרת מברשת אמנות עגולה. לוחות פטרי אלה מצולמים או נסרקים ברזולוציה גבוהה כדי לתעד את תכונות ה-RSA. תכונות השורש, כגון שורש ראשוני, שורשים רוחביים ואזור הסתעפות, נמדדות באמצעות תוכנת ImageJ הזמינה באופן חופשי. מחקר זה מספק טכניקות למדידת מאפייני שורשי צמחים בסביבות סביבתיות מבוקרות. אנו דנים כיצד (1) לגדל את הצמחים, לאסוף ולהפיץ דגימות שורש, (2) להשיג תמונות של דגימות RSA מפוזרות, (3) ללכוד את התמונות, ו-(4) להשתמש בתוכנה לניתוח תמונות כדי לכמת תכונות שורש. יתרונה של השיטה הנוכחית הוא המדידה הרבגונית, הקלה והיעילה של תכונות ה-RSA.
Introduction
ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA), שהיא תת-קרקעית, היא איבר חיוני לגידול צמחים ולפרודוקטיביות 1,2,3. לאחר השלב העוברי, הצמחים עוברים את השינויים המורפולוגיים המשמעותיים ביותר שלהם. האופן שבו השורשים גדלים בקרקע משפיע מאוד על צמיחת חלקי הצמח מעל פני הקרקע. צמיחת שורשים היא הצעד הראשון בנביטה. זוהי תכונה אינפורמטיבית שכן היא מגיבה באופן ייחודי לחומרים מזינים זמינים שונים 1,2,3,4. RSA מפגין רמה גבוהה של פלסטיות התפתחותית, כלומר הסביבה משמשת תמיד לקבלת החלטות על פיתוח 2,5. שינויים בסביבה הקשו על ייצור היבול בתרחיש הנוכחי. באופן רציף, ה-RSA משלב אותות סביבתיים בבחירות התפתחותיות5. כתוצאה מכך, הבנה מעמיקה של העקרונות העומדים מאחורי התפתחות שורשים חיונית ללמידה כיצד צמחים מגיבים לסביבות משתנות 2,5.
ה-RSA חש ריכוזים תזונתיים משתנים ומבצע שינויים פנוטיפיים 4,6,7,8,9,10,11,12. מחקרים מראים שמורפולוגיה של שורשים/RSA היא פלסטית מאוד בהשוואה למורפולוגיה של יורה 1,3. מיפוי תכונות RSA יעיל ביותר ברישום ההשפעה שלשינוי סביבת הקרקע הסובבת 1,11,12.
באופן כללי, פערים בהשפעה של חוסרים תזונתיים שונים על פנוטיפ השורש דווחו במחקרים קודמים רבים 3,11,13,14,15. לדוגמה, ישנם מספר דיווחים מנוגדים על שינויים הנגרמים על ידי רעב פוספט (Pi) במספר, אורך וצפיפות של שורשים רוחביים (LR). עלייה בצפיפות LR דווחה תחת מצב חסר Pi 6,8. לעומת זאת, ירידה בצפיפות LR בתנאים של מחסור ב-Pi דווחה גם על ידי מחברים אחרים 3,13,16. אחד הגורמים הבולטים לחוסר עקביות זה הוא השימוש במדיום הג’לינג הנוטה לזיהום יסודי, אשר אגר מכיל לעתים קרובות10. חוקרים בדרך כלל מגדלים את צמחי הניסוי שלהם על מערכת לוחות מבוססת אגר ורושמים את תכונות השורש. תכונות RSA רבות מוסתרות או מעוגנות לעתים קרובות בתוך חומר האגר ולא ניתן לתעדן. ניסויים הקשורים לגרימת מחסור בחומרים מזינים, שבהם משתמשים לעתים קרובות מוציאים רכיב אחד לחלוטין מהמדיום, אינם יכולים להתבצע בתווך ג’ל הנוטה לזיהום יסודי11,14,15. חומרים מזינים רבים נמצאים לעתים קרובות בכמויות משמעותיות במדיה אגר, כולל P, Zn, Fe, ועוד רבים 11,14,15. יתר על כן, צמיחת RSA איטית יותר במדיה מבוססת אגר מאשר בתווך נוזלי שאינו מבוסס אגר. כתוצאה מכך, יש צורך לבסס גישה חלופית שאינה מבוססת אגר לכימות ורישום איכותי של הפנוטיפ של RSA. כתוצאה מכך, פותחה השיטה הנוכחית, שבה מגדלים פלנטלים במערכת הידרופונית מבוססת קופסת מגנטה על גבי רשת פוליפרופילן הנתמכת על ידי טריזי פוליקרבונט 1,10,11.
מחקר זה מציג גרסה מאולתרת מפורטת של השיטה הקודמת שתוארה על ידי Jain et al.10. אסטרטגיה זו כווננה לדרישות הנוכחיות בביולוגיה של שורשי הצמח וניתן להשתמש בה גם עבור צמחים כמו אספסת, מלבד צמחי מודל. הפרוטוקול הוא הדרך העיקרית למדוד את השינויים ב-RSA, והוא דורש רק ציוד פשוט. הפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד לפנוטיפ מספר תכונות שורש, כגון שורשים ראשוניים ורוחביים בתווך נורמלי ושונה (חסר Pi). הוראות שלב אחר שלב ורמזים מועילים אחרים שלוקטו מחוויותיו של המחבר מסופקים כדי לעזור לחוקרים לעקוב אחר המתודולוגיות המוצעות בשיטה זו. המחקר הנוכחי נועד לספק שיטה פשוטה ויעילה לחשיפת כל מערכת השורשים של צמחים, כולל LR מסדר גבוה יותר. שיטה זו כוללת פיזור ידני של מערכת השורשים באמצעות מברשת עגולה בצבעי מים, המאפשרת שליטה מדויקת בחשיפת השורשים 1,10,11,12. זה לא דורש ציוד יקר או תוכנה מסובכת. שיטה זו שיפרה את ספיגת החומרים המזינים ואת קצב הצמיחה; לצמחים יש תמיסה עשירה בחומרים מזינים הנספגת בקלות על ידי שורשיהם. השיטה הנוכחית מתאימה לחוקרים המעוניינים למפות בפירוט את תכונות מערכת השורשים של הצמח, במיוחד במהלך ההתפתחות המוקדמת (10-15 ימים לאחר הנביטה). הוא מתאים למערכות שורשים קטנות, צמחי מודל כמו ארבידופסיס וטבק, וצמחים לא קונבנציונליים כמו אלפלפה עד שמערכת השורשים שלהם נכנסת לקופסאות המג’נטה.
השלבים לניתוח פנוטיפי של התפתחות RSA בארבידופסיס מתוארים בפרוטוקול זה כדלקמן: (1) שיטת עיקור פני השטח של זרעים לצמחים (Arabidopsis), (2) השלבים להקמת המערכת ההידרופונית, ולאחר מכן זריעת זרעים על מדיום, (3) הליך הוצאת הזריעה המלאה והתפשטות על צלחת פטרי לניתוח RSA, (4) כיצד להקליט את התמונות עבור RSA, ו-(5) לחשב פרמטרים חשובים של RSA באמצעות תוכנת ImageJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו הדגימה מיפוי RSA באמצעות ציוד מעבדה פשוט. באמצעות שיטה זו, שינויים פנוטיפיים נרשמים ברמה המעודנת. היתרון של אסטרטגיה זו הוא שחלק הצילומים לעולם לא בא במגע עם התקשורת, ולכן הפנוטיפ של הצמחים הוא מקורי. שיטה זו כוללת הקמת מערכת הידרופונית לגידול צמחים כמתואר בפרוטוקול. לאחר מכן, מוציא…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למשרד החקלאות האמריקאי (מענק 58-6406-1-017) על תמיכתו במחקר זה. אנו מודים גם למרכז הביוטכנולוגיה WKU, אוניברסיטת מערב קנטקי, באולינג גרין, KY, ארה”ב, ולמנהל המכון המרכזי CSIR לצמחי מרפא וריח, לאקנאו, הודו, על אספקת מתקני המכשיר והתמיכה (CSIR CIMAP manuscript communication no. CIMAP/PUB/2022/103). SS מודה על התמיכה הכספית מאוניברסיטת סנט ג’וזף, פילדלפיה, ארה”ב.
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
Referências
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. . National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
