Un semplice protocollo per mappare i tratti dell'architettura del sistema di root delle piante
Summary
Utilizziamo semplici strumenti di laboratorio per esaminare l’architettura del sistema di root (RSA) di Arabidopsis e Medicago. Le piantine vengono coltivate idroponicamente su rete e distribuite usando un pennello artistico per rivelare la RSA. Le immagini vengono scattate utilizzando la scansione o una fotocamera ad alta risoluzione, quindi analizzate con ImageJ per mappare i tratti.
Abstract
Una conoscenza completa dello sviluppo dell’architettura del sistema radicale delle piante (RSA) è fondamentale per migliorare l’efficienza nell’uso dei nutrienti e aumentare la tolleranza delle cultivar alle sfide ambientali. Viene presentato un protocollo sperimentale per la configurazione del sistema idroponico, la crescita delle piantine, la diffusione di RSA e l’imaging. L’approccio ha utilizzato un sistema idroponico a base di scatola magenta contenente rete in polipropilene supportata da cunei in policarbonato. Le impostazioni sperimentali sono esemplificate valutando l’RSA delle piantine sotto apporto variabile di nutrienti (fosfato [Pi]). Il sistema è stato istituito per esaminare la RSA di Arabidopsis, ma è facilmente adattabile per studiare altre piante come Medicago sativa (Alfalfa). Le piantine di Arabidopsis thaliana (Col-0) sono utilizzate in questa indagine come esempio per comprendere la pianta RSA. I semi vengono sterilizzati in superficie trattando etanolo e candeggina commerciale diluita e mantenuti a 4 °C per la stratificazione. I semi vengono germinati e coltivati su un mezzo liquido semi-MS su una rete di polipropilene sostenuta da cunei in policarbonato. Le piantine vengono coltivate in condizioni di crescita standard per il numero desiderato di giorni, raccolte delicatamente dalla rete e immerse in piastre di agar contenenti acqua. Ogni apparato radicale delle piantine viene distribuito delicatamente sulla piastra piena d’acqua con l’aiuto di un pennello rotondo. Queste lastre di Petri vengono fotografate o scansionate ad alta risoluzione per documentare i tratti RSA. I tratti radice, come la radice primaria, le radici laterali e la zona di ramificazione, vengono misurati utilizzando il software ImageJ disponibile gratuitamente. Questo studio fornisce tecniche per misurare le caratteristiche delle radici delle piante in ambienti ambientali controllati. Discutiamo su come (1) coltivare le piantine e raccogliere e diffondere campioni di radici, (2) ottenere immagini di campioni RSA diffusi, (3) acquisire le immagini e (4) utilizzare il software di analisi delle immagini per quantificare gli attributi radice. Il vantaggio del presente metodo è la misurazione versatile, facile ed efficiente dei tratti RSA.
Introduction
L’architettura del sistema radicale (RSA), che è sotterranea, è un organo vitale per la crescita e la produttività delle piante 1,2,3. Dopo lo stadio embrionale, le piante subiscono i loro cambiamenti morfologici più significativi. Il modo in cui le radici crescono nel terreno influisce notevolmente sulla crescita delle parti delle piante fuori terra. La crescita delle radici è il primo passo nella germinazione. È un tratto informativo in quanto risponde in modo univoco ai diversi nutrienti disponibili 1,2,3,4. L’RSA presenta un alto grado di plasticità dello sviluppo, il che significa che l’ambiente viene sempre utilizzato per prendere decisioni sullo sviluppo 2,5. I cambiamenti nell’ambiente hanno reso la produzione agricola più difficile nello scenario attuale. Su base continuativa, la RSA incorpora i segnali ambientali nelle scelte di sviluppo5. Di conseguenza, una conoscenza approfondita dei principi alla base dello sviluppo delle radici è essenziale per imparare come le piante rispondono ai cambiamenti ambientali 2,5.
L’RSA rileva concentrazioni variabili di nutrienti e rende alterazioni fenotipiche 4,6,7,8,9,10,11,12. Gli studi suggeriscono che la morfologia delle radici/RSA è altamente plastica rispetto alla morfologia del germoglio 1,3. La mappatura dei tratti RSA è altamente efficace nel registrare l’effetto del cambiamento dell’ambiente circostante del suolo 1,11,12.
In generale, discrepanze nell’effetto di varie carenze nutrizionali sul fenotipo radicale sono state riportate in molti studi precedenti 3,11,13,14,15. Ad esempio, ci sono diversi rapporti contrastanti sui cambiamenti indotti dalla fame di fosfato (Pi) nel numero, nella lunghezza e nella densità delle radici laterali (LR). Un aumento della densità di LR è stato riportato nella condizione di deficit di Pi 6,8. Al contrario, una diminuzione della densità di LR in condizioni di carenza di Pi greco è stata riportata anche da altri autori 3,13,16. Una delle cause principali di queste incongruenze è l’uso del mezzo gelificante soggetto a contaminazione elementare, che l’agar spesso contiene10. I ricercatori in genere coltivano le loro piante sperimentali su un sistema di piastre a base di agar e registrano i tratti delle radici. Numerosi tratti RSA sono spesso nascosti o trincerati all’interno del materiale agar e non possono essere documentati. Gli esperimenti legati all’induzione di carenza di nutrienti, in cui gli utenti spesso escludono totalmente un componente dal mezzo, non possono essere eseguiti in un mezzo gelificante soggetto a contaminazione elementare11,14,15. Numerosi nutrienti sono frequentemente presenti in quantità significative nei mezzi agar, tra cui P, Zn, Fe e molti altri11,14,15. Inoltre, la crescita dell’RSA è più lenta nei terreni a base di agar rispetto ai mezzi liquidi non a base di agar. Di conseguenza, è necessario stabilire un approccio alternativo non basato su agar per quantificare e registrare qualitativamente il fenotipo di RSA. Di conseguenza, è stato sviluppato il metodo attuale, in cui le piantine vengono allevate in un sistema idroponico a base di scatola magenta in cima a una rete di polipropilene supportata da cunei in policarbonato 1,10,11.
Questo studio presenta una versione improvvisata dettagliata del metodo precedente descritto da Jain et al.10. Questa strategia è stata messa a punto per le attuali esigenze della biologia delle radici delle piante e può essere utilizzata anche per piante come l’erba medica, diverse dalle piante modello. Il protocollo è il modo principale per misurare i cambiamenti in RSA e richiede solo apparecchiature semplici. Il presente protocollo illustra come fenotipizzare diverse caratteristiche della radice, come le radici primarie e laterali in mezzo normale e modificato (deficit di Pi greco). Vengono fornite indicazioni passo-passo e altri suggerimenti utili raccolti dalle esperienze dell’autore per aiutare i ricercatori a seguire le metodologie offerte in questo metodo. Il presente studio mira a fornire un metodo semplice ed efficace per rivelare l’intero apparato radicale delle piante, compresi gli LR di ordine superiore. Questo metodo prevede la diffusione manuale del sistema radicale con un pennello rotondo per acquerello, consentendo un controllo preciso sull’esposizione delle radici 1,10,11,12. Non richiede attrezzature costose o software complicati. Questo metodo ha migliorato l’assorbimento dei nutrienti e il tasso di crescita; Le piante hanno una soluzione ricca di sostanze nutritive facilmente assorbita dalle loro radici. Il presente metodo è adatto per i ricercatori che desiderano mappare i tratti del sistema radicale di una pianta in dettaglio, in particolare durante lo sviluppo precoce (10-15 giorni dopo la germinazione). È adatto per piccoli sistemi radicali, piante modello come Arabidopsis e tabacco e piante non convenzionali come l’erba medica fino a quando il loro apparato radicale non si adatta alle scatole magenta.
Le fasi per l’analisi fenotipica dello sviluppo di RSA in Arabidopsis sono descritte in questo protocollo come segue: (1) il metodo di sterilizzazione della superficie del seme per le piante (Arabidopsis), (2) le fasi per impostare il sistema idroponico, seguite dalla semina dei semi su un terreno, (3) procedura per estrarre le piantine complete e spargere sulla piastra di Petri per l’analisi RSA, (4) come registrare le immagini per RSA e (5) calcolare importanti parametri RSA utilizzando il software ImageJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro ha dimostrato la mappatura di RSA utilizzando semplici apparecchiature di laboratorio. Utilizzando questo metodo, le alterazioni fenotipiche vengono registrate a livello raffinato. Il vantaggio di questa strategia è che la porzione di germoglio non entra mai in contatto con i media, quindi il fenotipo delle piantine è originale. Questo metodo prevede la creazione di un sistema idroponico per coltivare le piantine come descritto nel protocollo. Quindi, ogni piantina viene estratta intatta e posta su una pi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti (sovvenzione 58-6406-1-017) per aver sostenuto questa ricerca. Riconosciamo anche il WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, USA, e il direttore, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, India, per aver fornito le strutture e il supporto dello strumento (comunicazione manoscritta CSIR CIMAP n. CIMAP / PUB / 2022/103). SS riconosce il sostegno finanziario della Saint Joseph’s University, Philadelphia, USA.
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
Referências
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. . National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
