植物の根系アーキテクチャ特性をマッピングするための簡単なプロトコル
Summary
簡単な実験ツールを使用して、シロイヌナズナとメディカゴの根系アーキテクチャ(RSA)を調べます。小植物はメッシュ上で水耕栽培され、アートブラシを使用して広げられ、RSAが明らかになります。画像はスキャンまたは高解像度カメラを使用して撮影され、ImageJで分析されて形質をマッピングします。
Abstract
植物の根系構造(RSA)開発に関する包括的な知識は、栄養素の使用効率を改善し、環境問題に対する作物品種の耐性を高めるために重要です。水耕栽培システムのセットアップ、植物の成長、RSAの拡散、およびイメージングのための実験プロトコルが提示されます。このアプローチでは、ポリカーボネートウェッジで支えられたポリプロピレンメッシュを含むマゼンタボックスベースの水耕栽培システムを使用しました。実験設定は、様々な栄養素(リン酸塩[Pi])供給下での苗床のRSAを評価することによって例示される。このシステムはシロイヌナズナのRSAを調べるために設立されましたが、 メディカゴサティバ (アルファルファ)などの他の植物の研究にも容易に適応できます。 シロイヌナ ズナ(Col-0)の植物を本調査では、植物RSAを理解するための例として用いる。種子は、エタノールと希釈された市販の漂白剤を処理することによって表面滅菌され、層別化のために4°Cに保たれます。種子を発芽させ、ポリカーボネートウェッジで支持されたポリプロピレンメッシュ上の液体ハーフMS培地上で成長させる。植物を標準的な生育条件下で所望の日数だけ生育させ、メッシュから穏やかに摘み取り、含水寒天プレートに浸す。小植物の各根系は、丸いアートブラシの助けを借りて、水で満たされたプレート上に穏やかに広げられます。これらのペトリプレートは、RSA特性を文書化するために高解像度で撮影またはスキャンされます。一次根、側根、分岐ゾーンなどの根形質は、無料で入手できるImageJソフトウェアを使用して測定されます。この研究は、制御された環境環境における植物の根の特性を測定するための技術を提供します。(1)苗を育て、根のサンプルを採取して広げる方法、(2)拡散したRSAサンプルの写真を取得する方法、(3)画像をキャプチャする方法、(4)画像解析ソフトウェアを使用して根の属性を定量化する方法について説明します。本方法の利点は、RSA形質の汎用性が高く、簡単で効率的な測定である。
Introduction
地下にある根系アーキテクチャ(RSA)は、植物の成長と生産性にとって重要な器官です1,2,3。胚期の後、植物はそれらの最も重要な形態学的変化を経験する。根が土壌中で成長する方法は、地上の植物部分の成長に大きく影響します。根の成長は発芽の最初のステップです。それは異なる利用可能な栄養素1,2,3,4に独自に反応するので、それは有益な形質です。RSAは高度な発達可塑性を示し、これは環境が常に開発に関する決定を行うために使用されることを意味します2,5。環境の変化により、現在のシナリオでは作物生産がより困難になっています。RSAは継続的に、環境シグナルを発達上の選択に組み込んでいます5。その結果、根の発達の背後にある原理を完全に理解することは、植物が変化する環境にどのように反応するかを学ぶために不可欠です2,5。
RSAは、さまざまな栄養素濃度を感知し、表現型の変化をレンダリングします4、6、7、8、9、10、11、12。研究によると、根の形態/ RSAはシュートの形態と比較して非常に可塑性が高いことが示唆されています1,3。RSA形質マッピングは、周囲の土壌環境を変化させる効果を記録するのに非常に有効である1、11、12。
一般に、根の表現型に対する様々な栄養欠乏の影響の不一致は、多くの以前の研究で報告されている3、11、13、14、15。たとえば、リン酸塩(Pi)飢餓による側根(LR)の数、長さ、密度の変化については、いくつかの対照的な報告があります。LR密度の増加は、Pi欠乏条件6,8の下で報告されています。対照的に、Pi欠損条件下でのLR密度の減少は、他の著者によっても報告されています3,13,16。これらの不一致の顕著な原因の1つは、寒天がしばしば10を含む元素汚染しやすいゲル化培地の使用です。研究者は通常、寒天ベースのプレートシステムで実験植物を育て、根の形質を記録します。多くのRSA形質は、寒天物質内に隠蔽または定着していることが多く、文書化することはできません。ユーザーが培地から1つの成分を完全に排除することが多い栄養欠乏症の誘発に関連する実験は、元素汚染が発生しやすいゲル化培地では実行できません11、14、15。寒天培地には、P、Zn、Feなど、多数の栄養素が大量に頻繁に存在します11、14、15。さらに、RSAの成長は、非寒天ベースの液体培地よりも寒天ベースの培地の方が遅い。その結果、RSAの表現型を定量化し定性的に記録するための代替の非寒天ベースのアプローチを確立する必要があります。その結果、ポリカーボネートウェッジ1,10,11で支持されたポリプロピレンメッシュの上にマゼンタボックスベースの水耕栽培システムで苗を飼育する現在の方法が開発されました。
この研究は、Jainらによって記述された以前の方法の詳細な即興バージョンを提示します10。この戦略は、植物の根生物学における現在の需要に合わせて調整されており、モデル植物以外のアルファルファのような植物にも使用できます。プロトコルは、RSAの変化を測定するための主要な方法であり、必要なのは単純な機器だけです。本プロトコルは、正常および改変培地(Pi欠損)において一次根および側根などのいくつかの根の特徴を表現型化する方法を示す。著者の経験から収集された段階的な指示やその他の役立つヒントは、研究者がこの方法で提供される方法論に従うのを助けるために提供されます。本研究は、高次LRを含む植物の根系全体を簡便かつ効果的に明らかにする手法を提供することを目的とする。この方法では、丸い水彩アートブラシを使用して根系を手動で広げ、根の露出を正確に制御できます1,10,11,12。高価な機器や複雑なソフトウェアは必要ありません。この方法は、栄養素の取り込みと成長率を改善しました。植物は根に吸収されやすい栄養豊富な溶液を持っています。この方法は、特に発育初期(発芽後10〜15日)に、植物の根系の形質を詳細にマッピングしたい研究者に適しています。小さな根系、シロイヌナズナやタバコなどのモデル植物、アルファルファなどの非従来型植物に、根系がマゼンタの箱に収まるまで適しています。
シロイヌナズナにおけるRSA発生の表現型分析のステップは、このプロトコルで次のように概説されています:(1)植物の種子表面滅菌の方法(シロイヌナズナ)、(2)水耕システムをセットアップするステップ、続いて培地に種子を播種するステップ、(3)RSA分析のために完全な播種を取り出してペトリプレート上に広げる手順、 (4)RSA用の画像を記録する方法、および(5)ImageJソフトウェアを使用して重要なRSAパラメータを計算する方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
この作業では、シンプルな実験装置を使用したRSAのマッピングを実証しました。この方法を使用して、表現型の変化が洗練されたレベルで記録されます。この戦略の利点は、シュート部分がメディアと接触することがないため、小植物の表現型がオリジナルであることです。この方法では、プロトコルに記載されているように、水耕栽培システムを設定して小植物を栽培します。次に、各苗?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、この研究を支援してくれた米国農務省(Grant 58-6406-1-017)に感謝しています。また、米国ケンタッキー州ボーリンググリーンの西ケンタッキー大学のWKUバイオテクノロジーセンターと、インドのラクナウにあるCSIR薬用芳香植物中央研究所の所長が機器の設備とサポートを提供してくれたことに感謝します(CSIR CIMAP原稿通信番号CIMAP / PUB / 2022/103)。SSは、米国フィラデルフィアのセントジョセフ大学からの財政的支援を認めています。
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
Referências
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. . National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
