Un protocolo simple para mapear los rasgos de arquitectura del sistema radicular de la planta
Summary
Utilizamos herramientas de laboratorio simples para examinar la arquitectura del sistema radicular (RSA) de Arabidopsis y Medicago. Las plántulas se cultivan hidropónicamente sobre malla y se extienden usando un pincel artístico para revelar el RSA. Las imágenes se toman mediante escaneo o una cámara de alta resolución, luego se analizan con ImageJ para mapear rasgos.
Abstract
El conocimiento integral del desarrollo de la arquitectura del sistema radicular de las plantas (RSA) es fundamental para mejorar la eficiencia del uso de nutrientes y aumentar la tolerancia de los cultivadores de cultivos a los desafíos ambientales. Se presenta un protocolo experimental para configurar el sistema hidropónico, el crecimiento de las plántulas, la propagación de RSA y la obtención de imágenes. El enfoque utilizó un sistema hidropónico basado en caja magenta que contenía malla de polipropileno soportada por cuñas de policarbonato. Los ajustes experimentales se ejemplifican evaluando el RSA de las plántulas bajo un suministro variable de nutrientes (fosfato [Pi]). El sistema se estableció para examinar el RSA de Arabidopsis, pero es fácilmente adaptable para estudiar otras plantas como Medicago sativa (Alfalfa). Las plántulas de Arabidopsis thaliana (Col-0) se utilizan en esta investigación como ejemplo para comprender la planta RSA. Las semillas se esterilizan en la superficie mediante el tratamiento de etanol y lejía comercial diluida, y se mantienen a 4 °C para su estratificación. Las semillas se germinan y se cultivan en un medio líquido semi-MS sobre una malla de polipropileno soportada por cuñas de policarbonato. Las plántulas se cultivan en condiciones de crecimiento estándar durante el número deseado de días, se recogen suavemente de la malla y se sumergen en placas de agar que contienen agua. Cada sistema de raíces de las plántulas se extiende suavemente sobre la placa llena de agua con la ayuda de un pincel de arte redondo. Estas placas de Petri se fotografían o escanean a alta resolución para documentar los rasgos RSA. Los rasgos de la raíz, como la raíz primaria, las raíces laterales y la zona de ramificación, se miden utilizando el software ImageJ disponible gratuitamente. Este estudio proporciona técnicas para medir las características de las raíces de las plantas en entornos ambientales controlados. Discutimos cómo (1) cultivar las plántulas y recolectar y esparcir muestras de raíces, (2) obtener imágenes de muestras RSA extendidas, (3) capturar las imágenes y (4) usar software de análisis de imágenes para cuantificar los atributos de la raíz. La ventaja del método actual es la medición versátil, fácil y eficiente de los rasgos RSA.
Introduction
La arquitectura del sistema radicular (RSA), que es subterránea, es un órgano vital para el crecimiento y la productividad de las plantas 1,2,3. Después de la etapa embrionaria, las plantas experimentan sus cambios morfológicos más significativos. La forma en que crecen las raíces en el suelo afecta en gran medida el crecimiento de las partes de la planta sobre el suelo. El crecimiento de la raíz es el primer paso en la germinación. Es un rasgo informativo ya que responde de manera única a diferentes nutrientes disponibles 1,2,3,4. El RSA exhibe un alto grado de plasticidad del desarrollo, lo que significa que el ambiente siempre se utiliza para tomar decisiones sobre el desarrollo 2,5. Los cambios en el medio ambiente han dificultado la producción de cultivos en el escenario actual. De forma continua, el RSA incorpora señales ambientales en las opciones de desarrollo5. Como resultado, una comprensión profunda de los principios detrás del desarrollo de las raíces es esencial para aprender cómo las plantas responden a los ambientes cambiantes 2,5.
El RSA detecta concentraciones variables de nutrientes y produce alteraciones fenotípicas 4,6,7,8,9,10,11,12. Los estudios sugieren que la morfología de la raíz/RSA es altamente plástica en comparación con la morfología del brote 1,3. El mapeo de rasgos RSA es altamente efectivo para registrar el efecto de cambiar el ambiente del suelo circundante 1,11,12.
En general, las discrepancias en el efecto de diversas deficiencias de nutrientes en el fenotipo de la raíz han sido reportadas en muchos estudios anteriores 3,11,13,14,15. Por ejemplo, hay varios informes contrastantes sobre los cambios inducidos por la inanición de fosfato (Pi) en el número, la longitud y la densidad de las raíces laterales (LR). Se ha reportado un aumento en la densidad de LR bajo la condición deficiente Pi 6,8. En contraste, una disminución en la densidad de LR en condiciones deficientes de Pi también ha sido reportada por otros autores 3,13,16. Una de las causas prominentes de estas inconsistencias es el uso del medio gelificante propenso a la contaminación elemental, que el agar a menudo contiene10. Los investigadores suelen cultivar sus plantas experimentales en un sistema de placas a base de agar y registran los rasgos de la raíz. Numerosos rasgos de RSA están frecuentemente ocultos o arraigados dentro del material de agar y no pueden ser documentados. Los experimentos relacionados con la inducción de deficiencia de nutrientes, en los que los usuarios a menudo excluyen un componente totalmente del medio, no pueden realizarse en un medio gelificante propenso a la contaminación elemental11,14,15. Numerosos nutrientes están frecuentemente presentes en cantidades significativas en los medios de agar, incluyendo P, Zn, Fe, y muchos más11,14,15. Además, el crecimiento de RSA es más lento en medios basados en agar que en medios líquidos no basados en agar. Como resultado, es necesario establecer un enfoque alternativo no basado en agar para cuantificar y registrar cualitativamente el fenotipo de RSA. En consecuencia, se ha desarrollado el método actual, en el que las plántulas se crían en un sistema hidropónico basado en caja magenta sobre una malla de polipropileno soportada por cuñas de policarbonato 1,10,11.
Este estudio presenta una versión improvisada detallada del método anterior descrito por Jain et al.10. Esta estrategia se ha ajustado para las demandas actuales en la biología de las raíces de las plantas y también se puede utilizar para plantas como la alfalfa, que no sean plantas modelo. El protocolo es la forma principal de medir los cambios en RSA, y solo requiere un equipo simple. El presente protocolo ilustra cómo fenotipar varias características radiculares, como las raíces primarias y laterales en medio normal y modificado (Pi deficiente). Se proporcionan instrucciones paso a paso y otros consejos útiles extraídos de las experiencias del autor para ayudar a los investigadores a seguir las metodologías ofrecidas en este método. El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un método simple y eficaz para revelar todo el sistema radicular de las plantas, incluidas las LR de orden superior. Este método consiste en extender manualmente el sistema radicular con un pincel de arte de acuarela redonda, lo que permite un control preciso sobre la exposición de las raíces 1,10,11,12. No requiere equipos costosos ni software complicado. Este método ha mejorado la absorción de nutrientes y la tasa de crecimiento; Las plantas tienen una solución rica en nutrientes fácilmente absorbida por sus raíces. El presente método es adecuado para investigadores que desean mapear los rasgos del sistema radicular de una planta en detalle, particularmente durante el desarrollo temprano (10-15 días después de la germinación). Es adecuado para sistemas radiculares pequeños, plantas modelo como Arabidopsis y tabaco, y plantas no convencionales como Alfalfa hasta que su sistema radicular encaje en las cajas magenta.
Los pasos para el análisis fenotípico del desarrollo de RSA en Arabidopsis se describen en este protocolo de la siguiente manera: (1) el método de esterilización de la superficie de la semilla para plantas (Arabidopsis), (2) los pasos para configurar el sistema hidropónico, seguido de la siembra de semillas en un medio, (3) procedimiento para extraer las siembras completas y esparcirlas en la placa de Petri para el análisis de RSA, (4) cómo grabar las imágenes para RSA, y (5) calcular parámetros RSA importantes utilizando el software ImageJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo demostró el mapeo de RSA utilizando equipos de laboratorio simples. Usando este método, las alteraciones fenotípicas se registran a nivel refinado. El beneficio de esta estrategia es que la porción del brote nunca entra en contacto con los medios, por lo que el fenotipo de las plántulas es original. Este método implica la configuración de un sistema hidropónico para cultivar plántulas como se describe en el protocolo. Luego, cada plántula se saca intacta y se coloca en una placa de Petri llena de a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos al Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (Subvención 58-6406-1-017) por apoyar esta investigación. También agradecemos al Centro de Biotecnología WKU, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, EE.UU., y al Director del Instituto Central de Plantas Medicinales y Aromáticas CSIR, Lucknow, India, por proporcionar las instalaciones y el apoyo del instrumento (comunicación manuscrita CSIR CIMAP NO. CIMAP/PUB/2022/103). SS reconoce el apoyo financiero de Saint Joseph’s University, Filadelfia, EE.UU.
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
Referências
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. . National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
