הקמה ותרבות של אורגנואידי שד שמקורם במטופל
Summary
פרוטוקול מפורט מסופק כאן לקביעת אורגנואידי שד אנושיים מכריתות גידולי שד שמקורם במטופל או מרקמת שד רגילה. הפרוטוקול מספק הוראות מקיפות שלב אחר שלב לגידול, הקפאה והפשרה של אורגנואידי שד אנושיים שמקורם במטופלות.
Abstract
סרטן השד היא מחלה מורכבת שסווגה למספר תת-סוגים היסטולוגיים ומולקולריים שונים. אורגנואידים של גידולי שד שמקורם במטופל שפותחו במעבדה שלנו מורכבים מתערובת של אוכלוסיות תאים מרובות שמקורן בגידול, ולכן מייצגים קירוב טוב יותר של מגוון תאי הגידול והסביבה מאשר קווי התאים הסרטניים הדו-ממדיים שנקבעו. אורגנואידים משמשים כמודל אידיאלי במבחנה, המאפשר אינטראקציות מטריצה תאית-חוץ-תאית, הידועות כממלאות תפקיד חשוב באינטראקציות תא-תא ובהתקדמות סרטן. לאורגנואידים שמקורם במטופל יש גם יתרונות על פני מודלים של עכברים מכיוון שהם ממקור אנושי. יתר על כן, הם הוכחו כדי לשחזר את ההטרוגניות הגנומית, transcriptomic כמו גם מטבולית של גידולים החולים; לפיכך, הם מסוגלים לייצג את מורכבות הגידול כמו גם את מגוון המטופלים. כתוצאה מכך, הם ערוכים לספק תובנות מדויקות יותר לגבי גילוי ואימות מטרות ומבחני רגישות לתרופות. בפרוטוקול זה, אנו מספקים הדגמה מפורטת של האופן שבו אורגנואידי שד שמקורם במטופל נקבעים מגידולי שד שנכרתו (אורגנואידים סרטניים) או מרקמת שד רדוקטיבית שמקורה בממופלסטיקה (אורגנואידים רגילים). זה ואחריו תיאור מקיף של תרבית אורגנואידים תלת ממדית, הרחבה, מעבר, הקפאה, כמו גם הפשרה של תרביות אורגנואידים שד שמקורם במטופל.
Introduction
סרטן השד (BC) הוא הממאירות הנפוצה ביותר בקרב נשים, עם 287,850 מקרים חדשים שאובחנו בארצות הברית בשנת 20221. למרות ההתקדמות האחרונה בגילוי מוקדם עם בדיקות סקר שנתיות, טיפולים ממוקדים והבנה טובה יותר של נטייה גנטית, הוא נחשב לגורם השני המוביל למוות מסרטן בקרב נשים בארצות הברית, עם >40,000 מקרי מוות המיוחסים לסרטן השד מדי שנה1. סרטן השד מסווג כיום למספר תת-סוגים בהתבסס על הערכה היסטופתולוגית ומולקולרית של הגידול הראשוני. ריבוד טוב יותר של תת-סוג שיפר את תוצאות המטופלים עם אפשרויות טיפול ספציפיות לתת-סוג2. לדוגמה, הזיהוי של HER2 כאב-אונקוגן3 הוביל לפיתוח של Trastuzumab, אשר הפך את תת-הסוג האגרסיבי הזה לניהול ברוב החולים4. מחקר נוסף על הגנטיקה והשעתוק של מחלה מורכבת זו באופן ספציפי למטופל יסייע בפיתוח וחיזוי משטרי טיפול מותאמים אישית ספציפיים למטופלטובים יותר 2,5. אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) הם מודל חדש ומבטיח להשגת תובנות לגבי סרטן ברמה המולקולרית, זיהוי מטרות חדשות או סמנים ביולוגיים ועיצוב אסטרטגיות טיפול חדשות 6,7,8.
PDOs הם מבנים רב-תאיים, תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) שמקורם בדגימות רקמה ראשוניות 8,9 שזה עתה נותחו. הם גדלים באופן תלת ממדי על ידי היותם מוטמעים במטריצת הידרוג’ל, המורכבת בדרך כלל משילוב של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים (ECM), ולכן ניתן להשתמש בהם לחקר אינטראקציות תאי גידול-ECM. PDOs מייצגים את מגוון המטופלים ומחזירים את ההטרוגניות התאית ואת התכונות הגנטיות של הגידול10,11,12. בהיותם מודלים במבחנה, הם מאפשרים מניפולציה גנטית ומסכי תרופות בתפוקה גבוהה13,14,15. יתר על כן, PDOs יכולים לשמש באופן סביר כדי להעריך את רגישות המטופל לתרופות ואסטרטגיות טיפול במקביל למרפאה ולעזור לחזות את תוצאות המטופל16,17,18. מלבד כימותרפיה, מודלים אורגנואידים מסוימים שימשו גם כדי לבחון תגובות של חולים בודדים לכימותרפיה19,20. בהתחשב ביישומם המבטיח של PDOs למחקר ולשימוש קליני, המכון הלאומי לסרטן יזם קונסורציום בינלאומי, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, כדי ליצור ולספק מודלים חדשים אלה של סרטן שמקורם בגידולים. רבים מהמודלים האורגנואידים של סוגי סרטן שונים שפותחו באמצעות HCMI זמינים באמצעות אוסף תרביות הטיפוסים האמריקאי (ATCC)22.
אורגנואידים נורמליים של השד הוכחו כמורכבים מאוכלוסיות שונות של תאי אפיתל הנמצאים בבלוטת החלב 11,23 ולכן משמשים כמודלים נהדרים לחקר תהליכים ביולוגיים בסיסיים, לניתוח מוטציות מניעות הגורמות לגידולים, ולמחקרי שושלת תאי מוצא סרטניים 6,15 . מודלים אורגנואידים של גידולי שד שימשו לזיהוי מטרות חדשות המעודדות סיכויים לפיתוח טיפולים חדשים, במיוחד עבור גידולים עמידים24,25,26. באמצעות שימוש במודלים מותאמים של קסנוגרפט נגזר ממטופל (PDX) ואורגנואיד נגזר PDX (PDxO) תואם של גידולי שד עמידים לטיפול, Guillen et al. הראו כי אורגנואידים הם מודלים רבי עוצמה לרפואה מדויקת, אשר ניתן למנף כדי להעריך תגובות לתרופות והחלטות טיפול ישירות במקביל28. יתר על כן, פיתוח שיטות תרבית משותפת חדשות לגידול PDOs עם תאים חיסוניים שונים27,28,29, פיברובלסטים 30,31 ומיקרובים 32,33 מהווה הזדמנות לחקור את ההשפעה של מיקרו-סביבה סרטנית על התקדמות סרטן. בעוד ששיטות רבות כאלה של תרבית משותפת נקבעות באופן פעיל עבור PDOs שמקורם בגידולים בלבלב או במעי הגס, שיטות תרבית משותפת מבוססות דומות עבור PDO השד דווחו רק עבור תאי הרג טבעיים34 ופיברובלסטים35.
הבנק הביולוגי הראשון של >100 אורגנואידים שמקורם במטופלות המייצגים תת-סוגים שונים של סרטן השד פותח על ידי קבוצת Hans Clevers36,37. כחלק ממאמץ זה, קבוצת Clevers פיתחה גם את מדיום התרבית המורכב הראשון לגידול אורגנואידים של השד, הנמצא כיום בשימוש נרחב36. מחקר המשך סיפק תיאור מקיף של ההקמה והתרבות של PDO שד וקסנוגרפטים אורגנואידים שמקורם במטופלות (PDOXs)38. מעבדת Welm פיתחה אוסף גדול של מודלים של BC PDX ו-PDxOs המתורבתים במדיום גידול פשוט יחסית המכיל נסיוב בקר עוברי (FBS) ופחות גורמי גדילה39,40. פיתחנו ואפיינו באופן עצמאי מערך גדול של מודלים נאיביים של אורגנואידים לסרטן השד שמקורם במטופלות11, והשתתפנו בפיתוח מודלים של BC PDO כחלק מיוזמת HCMI21. כאן, אנו שואפים לספק מדריך מעשי המפרט את המתודולוגיה בה אנו משתמשים ביצירת מערכות מודל אורגנואידים של שד הנגזרים ממטופלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
המעבדה שלנו השתמשה בהצלחה בפרוטוקולים הנ”ל כדי לבסס אורגנואידים מכריתות או שריטות גידולים נאיביות. השתמשנו בפרוטוקול זה גם כדי לפתח אורגנואידים נורמליים מרקמת השד המתקבלים באמצעות ממופלסטיקה רדוקטיבית או מרקמת שד רגילה סמוכה או דיסטלית של חולות סרטן. כ-30%-40% מהגידולים הראשוניים שנו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לחברי מעבדת ספקטור על דיונים ביקורתיים לאורך עבודה זו. אנו מודים לנורמן זקס ולהנס קלברס (מכון הוברכט, הולנד) על שסיפקו לנו בתחילה את פרוטוקול תרבית האורגנואידים שלהם. אנו מכירים במרכז הסרטן CSHL היסטולוגיה ומיקרוסקופ משאבים משותפים עבור שירותים ומומחיות טכנית (NCI 2P3OCA45508). אנו מודים לד”ר צ’ינג גאו על הסיוע בהכנת דגימות היסטולוגיות. אנו אסירי תודה על תמיכתה של ד”ר קארן קוסטרוף (Northwell Health) על מתן דגימות גידול למטופלים. אנו מעריכים גם את המאמצים של צוות Northwell Health Biobanking לרכישת דגימות, ומודים לחולים ולבני משפחותיהם על תרומת רקמות למחקר. מחקר זה נתמך על ידי CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.), ו-Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson and D.L.S).
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
- di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
- Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
- Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
- Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. &. #. 1. 9. 3. ;., Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
- Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Pesquisa do Câncer. , (2022).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
- Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
- Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- . HCMI Catalog Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022)
- . Search ATCC Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022)
- Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
- Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
- Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
- Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- . HUB Organoids: Patient in the lab Available from: https://www.huborganoids.nl (2022)
- Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
- Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
- . PDX Portal Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022)
- Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
- Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
- Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
- Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).
