रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर शोधन या सामान्य स्तन ऊतक से मानव स्तन ऑर्गेनोइड ्स स्थापित करने के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। प्रोटोकॉल मानव रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड्स की खेती, ठंड और पिघलने के लिए व्यापक चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है।
स्तन कैंसर एक जटिल बीमारी है जिसे कई अलग-अलग हिस्टोलॉजिकल और आणविक उपप्रकारों में वर्गीकृत किया गया है। हमारी प्रयोगशाला में विकसित रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स में कई ट्यूमर-व्युत्पन्न सेल आबादी का मिश्रण होता है, और इस प्रकार स्थापित 2 डी कैंसर सेल लाइनों की तुलना में ट्यूमर सेल विविधता और परिवेश का बेहतर अनुमान होता है। ऑर्गेनोइड्स एक आदर्श इन विट्रो मॉडल के रूप में काम करते हैं, जो सेल-बाह्य मैट्रिक्स इंटरैक्शन की अनुमति देते हैं, जो सेल-सेल इंटरैक्शन और कैंसर की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है। रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स में माउस मॉडल पर भी फायदे हैं क्योंकि वे मानव मूल के हैं। इसके अलावा, उन्हें रोगी ट्यूमर के जीनोमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक के साथ-साथ चयापचय विषमता को पुन: परिभाषित करने के लिए दिखाया गया है; इस प्रकार, वे ट्यूमर जटिलता के साथ-साथ रोगी विविधता का प्रतिनिधित्व करने में सक्षम हैं। नतीजतन, वे लक्ष्य खोज और सत्यापन और दवा संवेदनशीलता परख में अधिक सटीक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए तैयार हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम एक विस्तृत प्रदर्शन प्रदान करते हैं कि कैसे रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड्स को स्तन ट्यूमर (कैंसर ऑर्गेनोइड्स) या रिडक्टिव मैमोप्लास्टी-व्युत्पन्न स्तन ऊतक (सामान्य ऑर्गेनोइड्स) से स्थापित किया जाता है। इसके बाद 3 डी ऑर्गेनॉइड कल्चर, विस्तार, पासिंग, फ्रीजिंग, साथ ही रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के पिघलने का व्यापक विवरण है।
स्तन कैंसर (बीसी) महिलाओं में सबसे अधिक होने वाली घातकता है, 2022 में संयुक्त राज्य अमेरिका में 287,850 नए मामलों का निदान होने का अनुमानहै। वार्षिक स्क्रीनिंग, लक्षित उपचारों और आनुवंशिक प्रवृत्ति की बेहतर समझ के साथ शुरुआती पहचान में हालिया प्रगति के बावजूद, यह संयुक्त राज्य अमेरिका में महिलाओं में कैंसर से होने वाली मौतों का दूसरा प्रमुख कारण है, जिसमेंसालाना स्तन कैंसर के लिए >40,000 मौतें होती हैं। स्तन कैंसर को वर्तमान में प्राथमिक ट्यूमर के हिस्टोपैथोलॉजिकल और आणविक मूल्यांकन के आधार पर कई उपप्रकारों में वर्गीकृत किया गया है। बेहतर उपप्रकार स्तरीकरण ने उपप्रकार-विशिष्ट उपचार विकल्पों के साथ रोगी के परिणामों में सुधार कियाहै। उदाहरण के लिए, प्रोटो-ऑन्कोजीन3 के रूप में एचईआर 2 की पहचान ने ट्रास्टुज़ुमाब के विकास को जन्म दिया है, जिसने इस अत्यधिक आक्रामक उपप्रकार कोअधिकांश रोगियों में प्रबंधनीय बना दिया है। रोगी-विशिष्ट तरीके से इस जटिल बीमारी के आनुवंशिकी और ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स में आगे के शोध से बेहतर रोगी-विशिष्ट व्यक्तिगत उपचार आहार 2,5 को विकसित करने और भविष्यवाणी करने में सहायता मिलेगी। रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) आणविक स्तर पर कैंसर में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक आशाजनक नया मॉडल है, नए लक्ष्यों या बायोमाकर्स की पहचान करना और नई उपचार रणनीतियों को डिजाइन करना 6,7,8।
पीडीओ बहुकोशिकीय, त्रि-आयामी (3 डी) संरचनाएं हैं जो ताजा निकाले गए प्राथमिक ऊतकनमूने 8,9 से प्राप्त होती हैं। वे एक हाइड्रोगेल मैट्रिक्स में एम्बेडेड होने के द्वारा त्रि-आयामी रूप से उगाए जाते हैं, आमतौर पर बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के संयोजन से बना होता है, और इसलिए ट्यूमर सेल-ईसीएम इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पीडीओ रोगी विविधता का प्रतिनिधित्व करते हैं और ट्यूमर 10,11,12 की सेलुलर विषमता और आनुवंशिक विशेषताओं को पुन: परिभाषित करते हैं। इन विट्रो मॉडल होने के नाते, वे आनुवंशिक हेरफेर और उच्च-थ्रूपुट ड्रग स्क्रीन 13,14,15 की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, क्लिनिक के समानांतर रोगी दवा संवेदनशीलता और उपचार रणनीतियों का मूल्यांकन करने औररोगी के परिणामों की भविष्यवाणी करने में मदद करने के लिए पीडीओ का उपयोग किया जा सकता है। कीमोथेरेपी के अलावा, कुछ ऑर्गेनॉइड मॉडल का उपयोग केमोरेडिएशन19,20 के लिए व्यक्तिगत रोगी प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए भी किया गया है। अनुसंधान और नैदानिक उपयोग के लिए पीडीओ की आशाजनक प्रयोज्यता को देखते हुए, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान ने इन ट्यूमर-व्युत्पन्न उपन्यास कैंसर मॉडल को उत्पन्न करने और प्रदान करने के लिए एक अंतरराष्ट्रीय संघ, द ह्यूमन कैंसर मॉडल इनिशिएटिव (एचसीएमआई) 21 की शुरुआत की है। एचसीएमआई के माध्यम से विकसित विभिन्न कैंसर प्रकारों के कई ऑर्गेनॉइड मॉडल अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (एटीसीसी) 22 के माध्यम से उपलब्ध हैं।
सामान्य स्तन ऑर्गेनोइड्स को स्तन ग्रंथि11,23 में मौजूद विभिन्न उपकला कोशिका आबादी से युक्त दिखाया गया है और इस प्रकार बुनियादी जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने, ट्यूमरजेनिसिस के कारण चालक उत्परिवर्तन का विश्लेषण करने और कैंसर सेल-ऑफ-ओरिजिन वंशअध्ययनों के लिए महान मॉडल के रूप में काम करते हैं। . स्तन ट्यूमर ऑर्गेनॉइड मॉडल का उपयोग नए लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया गया है जो नए उपचारों को विकसित करने के लिए उत्साहजनक संभावनाएं हैं, विशेष रूप से प्रतिरोधी ट्यूमर 24,25,26 के लिए। उपचार-प्रतिरोधी स्तन ट्यूमर के रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) और मिलान पीडीएक्स-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड (पीडीएक्सओ) मॉडल का उपयोग करते हुए, गुइलेन एट अल ने दिखाया कि ऑर्गेनोइड सटीक चिकित्सा के लिए शक्तिशाली मॉडल हैं, जिनका उपयोग दवा प्रतिक्रियाओं और प्रत्यक्ष चिकित्सा निर्णयों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकताहै। इसके अलावा, विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं27,28,29, फाइब्रोब्लास्ट30,31 और रोगाणुओं 32,33 के साथ पीडीओ की खेती के लिए नए सह-संस्कृतिविधियों का विकास कैंसर की प्रगति पर ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के प्रभाव का अध्ययन करने का अवसर प्रस्तुत करता है। जबकि अग्नाशय या कोलोरेक्टल ट्यूमर से प्राप्त पीडीओ के लिए कई ऐसे सह-संस्कृति तरीके सक्रिय रूप से स्थापित किए जा रहे हैं, स्तन पीडीओ के लिए इसी तरह के स्थापित सह-संस्कृति विधियों को केवल प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं34 और फाइब्रोब्लास्ट35 के लिए रिपोर्ट किया गया है।
विभिन्न स्तन कैंसर उपप्रकारों का प्रतिनिधित्व करने वाले >100 रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का पहला बायोबैंक हंस क्लेवर्स समूह36,37 द्वारा विकसित किया गया था। इस प्रयास के हिस्से के रूप में, क्लेवर्स समूह ने स्तन ऑर्गेनॉइड विकास के लिए पहला जटिल संस्कृति माध्यम भी विकसित किया, जो वर्तमान में व्यापक रूप से उपयोग कियाजाता है। एक अनुवर्ती अध्ययन ने स्तन पीडीओ और रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड जेनोग्राफ्ट्स (पीडीओएक्स) 38 की स्थापना और संस्कृति का एक व्यापक विवरण प्रदान किया। वेल्म लैब ने बीसी पीडीएक्स मॉडल और पीडीएक्सओ का एक बड़ा संग्रह विकसित किया है जो भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और कम विकासकारकों 39,40 वाले तुलनात्मक रूप से सरल विकास माध्यम में सुसंस्कृत हैं। हमने स्वतंत्र रूप से भोले रोगी-व्युत्पन्न स्तन कैंसर ऑर्गेनॉइड मॉडल11 की एक बड़ी सरणी विकसित और विशेषता की है, और एचसीएमआई पहल21 के हिस्से के रूप में बीसी पीडीओ मॉडल विकसित करने में भाग लिया है। यहां, हम रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनॉइड मॉडल सिस्टम उत्पन्न करने में हमारे द्वारा नियोजित पद्धति का विवरण देते हुए एक व्यावहारिक मार्गदर्शिका प्रदान करना चाहते हैं।
हमारी प्रयोगशाला ने भोले ट्यूमर रिसेक्शन या स्क्रैपिंग से ऑर्गेनोइड्स स्थापित करने के लिए उपरोक्त प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक नियोजित किया है। हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग रिडक्टिव मैमोप्लास्टी के म?…
The authors have nothing to disclose.
हम इस काम के दौरान महत्वपूर्ण चर्चाओं के लिए स्पेक्टर लैब के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम नॉर्मन सैक्स और हंस क्लेवर्स (हबरेक्ट इंस्टीट्यूट, नीदरलैंड) को शुरू में हमें अपने ऑर्गेनोइड संवर्धन प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम सेवाओं और तकनीकी विशेषज्ञता (एनसीआई 2पी 3 ओसीए 45508) के लिए सीएसएचएल कैंसर सेंटर हिस्टोलॉजी और माइक्रोस्कोपी साझा संसाधनों को स्वीकार करते हैं। हम हिस्टोलॉजिकल नमूना तैयारी के साथ सहायता के लिए डॉ किंग गाओ को धन्यवाद देते हैं। हम रोगी ट्यूमर के नमूने प्रदान करने के लिए डॉ करेन कोस्ट्रोफ (नॉर्थवेल हेल्थ) के समर्थन के लिए आभारी हैं। हम नमूना अधिग्रहण के लिए नॉर्थवेल हेल्थ बायोबैंकिंग टीम के प्रयासों की भी सराहना करते हैं, और हम अनुसंधान के लिए ऊतकों को दान करने के लिए रोगियों और उनके परिवारों को धन्यवाद देते हैं। नॉर्थवेल हेल्थ (डीएलएस), एनसीआई 5पी01सीए013106-प्रोजेक्ट 3 (डीएलएस), और लीडोस बायोमेडिकल एचएचएसएन 26100008 (डेविड ट्यूवसन और डीएलएस) द्वारा समर्थित था।
15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
37 °C bead bath | |||
37 °C CO2 incubator | |||
50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
Parafilm | transparent film | ||
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |