Istituzione e coltura di organoidi mammari derivati da pazienti
Summary
Qui viene fornito un protocollo dettagliato per stabilire organoidi mammari umani da resezioni di tumore al seno derivate da pazienti o tessuto mammario normale. Il protocollo fornisce istruzioni dettagliate complete per la coltivazione, il congelamento e lo scongelamento degli organoidi mammari derivati dal paziente umano.
Abstract
Il cancro al seno è una malattia complessa che è stata classificata in diversi sottotipi istologici e molecolari. Gli organoidi del tumore mammario derivati dal paziente sviluppati nel nostro laboratorio consistono in un mix di più popolazioni cellulari derivate dal tumore e rappresentano quindi una migliore approssimazione della diversità e dell’ambiente delle cellule tumorali rispetto alle linee cellulari tumorali 2D stabilite. Gli organoidi fungono da modello ideale in vitro , consentendo interazioni cellula-matrice extracellulare, note per svolgere un ruolo importante nelle interazioni cellula-cellula e nella progressione del cancro. Gli organoidi derivati dal paziente hanno anche vantaggi rispetto ai modelli murini in quanto sono di origine umana. Inoltre, hanno dimostrato di ricapitolare l’eterogeneità genomica, trascrittomica e metabolica dei tumori dei pazienti; Pertanto, sono in grado di rappresentare la complessità del tumore e la diversità del paziente. Di conseguenza, sono pronti a fornire informazioni più accurate sulla scoperta e la convalida del target e sui saggi di sensibilità ai farmaci. In questo protocollo, forniamo una dimostrazione dettagliata di come gli organoidi mammari derivati dal paziente sono stabiliti da tumori al seno resecati (organoidi tumorali) o tessuto mammario derivato da mammoplastica riduttiva (organoidi normali). Questo è seguito da un resoconto completo della coltura di organoidi 3D, dell’espansione, del passaggio, del congelamento e dello scongelamento delle colture di organoidi mammari derivate dal paziente.
Introduction
Il cancro al seno (BC) è il tumore maligno più comune nelle donne, con 287.850 nuovi casi stimati per essere diagnosticati negli Stati Uniti nel 20221. Nonostante i recenti progressi nella diagnosi precoce con screening annuali, terapie mirate e una migliore comprensione della predisposizione genetica, prevale per essere la seconda causa di morte per cancro nelle donne negli Stati Uniti, con > 40.000 decessi attribuiti al cancro al seno ogni anno1. Il cancro al seno è attualmente classificato in più sottotipi sulla base della valutazione istopatologica e molecolare del tumore primario. Una migliore stratificazione dei sottotipi ha migliorato gli esiti dei pazienti con opzioni di trattamento specifiche per sottotipo2. Ad esempio, l’identificazione di HER2 come proto-oncogene3 ha portato allo sviluppo di Trastuzumab, che ha reso questo sottotipo altamente aggressivo gestibile nella maggior parte dei pazienti4. Ulteriori ricerche sulla genetica e la trascrittomica di questa complessa malattia in modo specifico per il paziente aiuteranno a sviluppare e prevedere migliori regimi di trattamento personalizzati specifici per il paziente 2,5. Gli organoidi derivati dal paziente (PDO) sono un nuovo modello promettente per ottenere informazioni sul cancro a livello molecolare, identificando nuovi bersagli o biomarcatori e progettando nuove strategie di trattamento 6,7,8.
Le DOP sono strutture multicellulari, tridimensionali (3D) derivate da campioni di tessuto primario appena resecati 8,9. Sono coltivati tridimensionalmente essendo incorporati in una matrice di idrogel, tipicamente composta da una combinazione di proteine della matrice extracellulare (ECM), e quindi possono essere utilizzati per studiare le interazioni cellula tumorale-ECM. Le DOP rappresentano la diversità dei pazienti e ricapitolano l’eterogeneità cellulare e le caratteristiche genetiche del tumore10,11,12. Essendo modelli in vitro, consentono la manipolazione genetica e screening farmacologici ad alto rendimento13,14,15. Inoltre, le PDO possono essere plausibilmente utilizzate per valutare la sensibilità ai farmaci del paziente e le strategie di trattamento in parallelo alla clinica e aiutare a prevedere gli esiti dei pazienti16,17,18. Oltre alla chemioterapia, alcuni modelli organoidi sono stati utilizzati anche per esaminare le risposte individuali dei pazienti alla chemioradioterapia19,20. Data la promettente applicabilità delle DOP per la ricerca e l’uso clinico, il National Cancer Institute ha avviato un consorzio internazionale, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, per generare e fornire questi nuovi modelli di cancro derivati dal tumore. Molti dei modelli organoidi di vari tipi di cancro sviluppati attraverso l’HCMI sono disponibili tramite l’American Type Culture Collection (ATCC)22.
È stato dimostrato che gli organoidi mammari normali sono composti da diverse popolazioni di cellule epiteliali presenti nella ghiandola mammaria 11,23 e quindi servono come grandi modelli per studiare i processi biologici di base, per analizzare le mutazioni driver che causano la tumorigenesi eper gli studi sulla linea delle cellule tumorali 6,15 . I modelli di organoidi del tumore al seno sono stati utilizzati per identificare nuovi bersagli che stanno incoraggiando le prospettive per lo sviluppo di nuove terapie, in particolare per i tumori resistenti24,25,26. Utilizzando modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) e organoidi derivati da PDX (PDxO) abbinati di tumori al seno resistenti al trattamento, Guillen et al. hanno dimostrato che gli organoidi sono potenti modelli per la medicina di precisione, che possono essere sfruttati per valutare le risposte ai farmaci e indirizzare le decisioni terapeutiche parallelamente28. Inoltre, lo sviluppo di nuovi metodi di co-coltura per la coltura di DOP con varie cellule immunitarie27,28,29, fibroblasti 30,31 e microbi 32,33 offre l’opportunità di studiare l’impatto del microambiente tumorale sulla progressione del cancro. Mentre molti di questi metodi di co-coltura sono attivamente stabiliti per le DOP derivate da tumori pancreatici o del colon-retto, simili metodi di co-coltura stabiliti per le DOP mammarie sono stati riportati solo per le cellule natural killer34 e i fibroblasti35.
La prima biobanca di >100 organoidi derivati da pazienti che rappresentano diversi sottotipi di cancro al seno è stata sviluppata dal gruppo Hans Clevers36,37. Come parte di questo sforzo, il gruppo Clevers ha anche sviluppato il primo terreno di coltura complesso per la crescita degli organoidi mammari, che è attualmente ampiamente utilizzato36. Uno studio di follow-up ha fornito un resoconto completo della creazione e della cultura delle DOP mammarie e degli xenotrapianti organoidi derivati dal paziente (PDOX)38. Il laboratorio Welm ha sviluppato una vasta collezione di modelli BC PDX e PDxO che sono coltivati in un mezzo di crescita relativamente più semplice contenente siero bovino fetale (FBS) e meno fattori di crescita39,40. Abbiamo sviluppato e caratterizzato in modo indipendente una vasta gamma di modelli di organoidi di carcinoma mammario naïve derivati da pazienti11 e abbiamo partecipato allo sviluppo di modelli BC DOP come parte dell’iniziativa HCMI21. Qui, miriamo a fornire una guida pratica che descriva in dettaglio la metodologia da noi impiegata nella generazione di sistemi modello di organoidi mammari derivati dal paziente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro laboratorio ha impiegato con successo i protocolli di cui sopra per stabilire organoidi da resezioni tumorali naïve o raschiamenti. Abbiamo anche utilizzato questo protocollo per sviluppare organoidi normali da tessuto mammario ottenuto tramite mammoplastica riduttiva o da tessuto mammario normale adiacente o distale di pazienti oncologici. Circa il 30% -40% dei tumori primari resecati ha portato a colture organoidi tumorali di successo a lungo termine (>passaggio 8). Le linee organoidi tumorali che s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Spector per le discussioni critiche nel corso di questo lavoro. Ringraziamo Norman Sachs e Hans Clevers (Hubrecht Institute, Paesi Bassi) per averci fornito inizialmente il loro protocollo di coltura organoide. Riconosciamo le risorse condivise di istologia e microscopia del CSHL Cancer Center per i servizi e le competenze tecniche (NCI 2P3OCA45508). Ringraziamo il Dr. Qing Gao per l’assistenza nella preparazione del campione istologico. Siamo grati per il supporto della dottoressa Karen Kostroff (Northwell Health) per aver fornito campioni di tumore ai pazienti. Apprezziamo anche gli sforzi del team di Northwell Health Biobanking per l’acquisizione di campioni e ringraziamo i pazienti e le loro famiglie per aver donato tessuti per la ricerca. Questa ricerca è stata supportata da CSHL / Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) e Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson e D.L.S).
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
Referências
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