Создание и культивирование органоидов молочной железы пациента

Published: February 17, 2023

doi:

Disha Aggarwal², Suzanne Russo, Payal Naik, Sonam Bhatia, David L. Spector²

¹Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, ²Genetics Graduate Program,Stony Brook University

Summary

Здесь приведен подробный протокол для определения органоидов молочной железы человека из резекций опухоли молочной железы пациента или нормальной ткани молочной железы. Протокол содержит исчерпывающие пошаговые инструкции по культивированию, замораживанию и размораживанию органоидов молочной железы, полученных от пациентов.

Abstract

Рак молочной железы является сложным заболеванием, которое было классифицировано на несколько различных гистологических и молекулярных подтипов. Органоиды опухолей молочной железы, полученные от пациентов, разработанные в нашей лаборатории, состоят из смеси нескольких популяций клеток, полученных из опухоли, и, таким образом, представляют собой лучшее приближение к разнообразию опухолевых клеток и среде, чем установленные 2D-линии раковых клеток. Органоиды служат идеальной моделью in vitro , позволяющей взаимодействовать между клетками и внеклеточным матриксом, которые, как известно, играют важную роль в межклеточных взаимодействиях и прогрессировании рака. Органоиды, полученные от пациентов, также имеют преимущества перед мышиными моделями, поскольку они имеют человеческое происхождение. Кроме того, было показано, что они повторяют геномную, транскриптомную, а также метаболическую гетерогенность опухолей пациентов; Таким образом, они способны представлять сложность опухоли, а также разнообразие пациентов. В результате они готовы предоставить более точную информацию об обнаружении и проверке мишеней, а также анализах чувствительности к лекарственным средствам. В этом протоколе мы предоставляем подробную демонстрацию того, как органоиды молочной железы, полученные от пациента, создаются из резецированных опухолей молочной железы (раковых органоидов) или ткани молочной железы, полученной из редуктивной маммопластики (нормальные органоиды). Затем следует всесторонний отчет о 3D-культуре органоидов, расширении, прохождении, замораживании, а также размораживании культур органоидов молочной железы, полученных от пациентов.

Introduction

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее часто встречающимся злокачественным новообразованием у женщин: по оценкам, в 2022 году в Соединенных Штатах будет диагностировано 287 850 новых случаев¹. Несмотря на недавние достижения в области раннего выявления с ежегодными скринингами, таргетной терапией и лучшим пониманием генетической предрасположенности, он является второй по значимости причиной смерти от рака у женщин в Соединенных Штатах, с > 40 000 смертей ежегодно от рака молочной железы¹. Рак молочной железы в настоящее время классифицируется на несколько подтипов на основе гистопатологической и молекулярной оценки первичной опухоли. Лучшая стратификация подтипов улучшила результаты лечения пациентов с вариантами лечения для конкретных подтипов². Например, идентификация HER2 как протоонкогена³ привела к разработке трастузумаба, который сделал этот высокоагрессивный подтип управляемым у большинства пациентов⁴. Дальнейшие исследования генетики и транскриптомики этого сложного заболевания с учетом специфики пациента помогут в разработке и прогнозировании более эффективных персонализированных схем лечения для конкретного пациента ^2,5. Органоиды, полученные от пациентов (PDO), являются многообещающей новой моделью для получения информации о раке на молекулярном уровне, выявления новых мишеней или биомаркеров и разработки новых стратегий лечения ^6,7,8.

PDO представляют собой многоклеточные трехмерные (3D) структуры, полученные из недавно резецированных первичных образцов тканей ^8,9. Они выращиваются трехмерно, будучи встроенными в гидрогелевую матрицу, обычно состоящую из комбинации белков внеклеточного матрикса (ECM), и, следовательно, могут использоваться для изучения взаимодействий опухолевой клетки с ECM. PDO представляют разнообразие пациентов и повторяют клеточную гетерогенность и генетические особенности опухоли^10,11,12. Будучи моделями in vitro, они позволяют проводить генетические манипуляции и высокопроизводительные скрининги лекарств^13,14,15. Кроме того, PDO могут быть правдоподобно использованы для оценки чувствительности пациента к лекарственным средствам и стратегий лечения параллельно с клиникой и помогают прогнозировать результаты лечения пациентов^16,17,18. Помимо химиотерапии, некоторые органоидные модели также использовались для изучения индивидуальных реакций пациентов на химиолучевую терапию^19,20. Учитывая многообещающую применимость PDO для исследований и клинического использования, Национальный институт рака инициировал международный консорциум The Human Cancer Models Initiative (HCMI)²¹ для создания и предоставления этих новых моделей рака, полученных из опухолей. Многие из органоидных моделей различных типов рака, разработанных с помощью HCMI, доступны через Американскую коллекцию типовых культур (ATCC)²².

Было показано, что нормальные органоиды молочной железы состоят из различных популяций эпителиальных клеток, присутствующих в молочной железе ^11,23, и, таким образом, служат отличными моделями для изучения основных биологических процессов, анализа мутаций-драйверов, вызывающих онкогенез, и для исследований происхождения раковых клеток ^6,15 . Органоидные модели опухолей молочной железы были использованы для идентификации новых мишеней, которые обнадеживают перспективы для разработки новых методов лечения, особенно для резистентных опухолей^24,25,26. Используя ксенотрансплантат пациента (PDX) и соответствующие модели органоидов, полученных из PDX (PDxO) резистентных к лечению опухолей молочной железы, Guillen et al. показали, что органоиды являются мощными моделями для точной медицины, которые могут быть использованы для параллельной оценки реакции на лекарства и принятия решений о прямой терапии²⁸. Кроме того, разработка новых методов совместного культивирования ЗОП с различными иммунными клетками^27,28,29, фибробластами 30,31 и микробами ^32,33 дает возможность изучить влияние микроокружения опухоли на прогрессирование рака. В то время как многие такие методы совместного культивирования активно внедряются для PDO, полученных из опухолей поджелудочной железы или колоректальных опухолей, аналогичные установленные методы совместного культивирования PDO молочной железы были зарегистрированы только для естественных клеток-киллеров³⁴ и фибробластов³⁵.

Первый биобанк из >100 органоидов, полученных от пациентов, представляющих различные подтипы рака молочной железы, был разработан группой Ханса Клеверса^36,37. В рамках этих усилий группа Clevers также разработала первую сложную питательную среду для роста органоидов молочной железы, которая в настоящее время широко используется³⁶. Последующее исследование предоставило всесторонний отчет о создании и культивировании PDO молочной железы и органоидных ксенотрансплантатов, полученных от пациентов (PDOX)³⁸. Лаборатория Welm разработала большую коллекцию моделей BC PDX и PDxO, которые культивируются в сравнительно более простой питательной среде, содержащей эмбриональную бычью сыворотку (FBS) и меньшее количество факторов роста^39,40. Мы независимо разработали и охарактеризовали большой массив наивных моделей органоидов рака молочной железы¹¹ и участвовали в разработке моделей BC PDO в рамках инициативы^{HCMI 21}. Здесь мы стремимся предоставить практическое руководство с подробным описанием методологии, используемой нами при создании систем моделей органоидов молочной железы, полученных от пациентов.

Protocol

Резекции опухолей у пациентов с раком молочной железы вместе с дистальными и прилегающими нормальными тканями были получены от Northwell Health в соответствии с протоколами Институционального наблюдательного совета IRB-03-012 и IRB 20-0150 и с письменного информированного согласия пациентов. <p class=…

Representative Results

Мы создали биобанк органоидов опухолей молочной железы, полученных от пациентов, включающий различные подтипы11. Кроме того, мы установили несколько нормальных органоидных линий молочной железы, полученных из образцов тканей редуктивной маммопластики или смежной/дисталь…

Discussion

Наша лаборатория успешно использовала вышеуказанные протоколы для создания органоидов из наивных опухолевых резекций или соскобов. Мы также использовали этот протокол для разработки нормальных органоидов из ткани молочной железы, полученной с помощью восстановительной маммоп?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Спектора за критические дискуссии на протяжении всей этой работы. Мы благодарим Нормана Сакса и Ханса Клеверса (Hans Clevers) из Института Хубрехта, Нидерланды за то, что они изначально предоставили нам свой протокол культивирования органоидов. Мы выражаем признательность Совместным ресурсам по гистологии и микроскопии Онкологического центра CSHL за услуги и техническую экспертизу (NCI 2P3OCA45508). Мы благодарим доктора Цин Гао за помощь в подготовке гистологического образца. Мы благодарны за поддержку доктору Карен Кострофф (Northwell Health) за предоставление пациентам образцов опухолей. Мы также высоко ценим усилия команды Northwell Health Biobanking по сбору образцов и благодарим пациентов и их семьи за пожертвование тканей для исследований. Это исследование было поддержано CSHL / Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) и Leidos Biomedical HHSN26100008 (Дэвид Тувесон и D.L.S.).

Materials

15 mL conical tubes	VWR	525-1068
175 cm² tissue culture flask	VWR (Corning)	29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO₂ incubator
50 mL conical tubes	VWR	525-1077
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter)	Millipore Sigma	SCGP00525	SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter	Nalgene	566-0020
6-well culture plates	Greiner Cellstar	82050-842
75 cm² tissue culture flask	VWR (Corning)	29185-304
96-well opaque plates	Corning	353296	For CTG assay
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B-27 supplement	Life Technologies	12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader	Fisher Scientific (Agilent)		For dual luciferase assay and CTG assay
BSA fraction V (7.5%)	Thermo Fisher	15260037
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent	Promega	G9683	luminescent cell viability assay
Centrifuge	Eppendorf	5804
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C5138	Type IV
Cryolabels	Amazon	DTCR-1000	Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5"
Cryovials	Simport Scientific Inc.	T311-1
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher (Gibco)	11995040
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)	Gibco	14190-144	DPBS
Epidermal growth factor (hEGF)	Peprotech	AF-100-15
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-010-CV
FGF-10 (human)	Peprotech	100-26
FGF-7/KGF (human)	Peprotech	100-19
GlutaMax	Life Technologies	35050061
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216	For TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells	R&D Systems	3710-001-01	Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPES	Life Technologies	15630-080
Heregulinβ-1 (human)	Peprotech	100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231	Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix
Mr. Frosty Cell Freezing Container	Thermo Fisher	5100-0001
Mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-418
N-acetyl-l-cysteine	Millipore Sigma	A9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher	166-0045
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636
Noggin (human)	Peprotech	120-10C
P1000, P200, P10 pipettes with tips
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190	Millipore Sigma	S7067
Parafilm			transparent film
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140122
Plasmid1: pRL-SV40P	Addgene	27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash	Addgene	12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash	Addgene	12456
pluriStrainer 200 µm	pluriSelect	43-50200-01
Primocin	Invivogen	ANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Thermo Fisher (Gibco)	12648-010	cell freezing medium
Red Blood Cell lysis buffer	Millipore Sigma	11814389001
R-spondin conditioned media	In-house or commercial from Peprotech	120-38
Scalpel (No.10)	Sklar Instruments	Jun-10
Shaker (Incu-shaker Mini)	Benchmark	H1001-M
TGF-β receptor inhibitor A 83-01	Tocris	2939
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Life Technologies	12605028	cell dissociation reagent
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent	Millipore Sigma	6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi)	Abmole Bioscience	Y-27632
Zeocin	Thermo Fisher	R25001

Referências

Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. &. #. 1. 9. 3. ;., Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Pesquisa do Câncer. , (2022).
Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
. HCMI Catalog Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022)
. Search ATCC Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022)
Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
. HUB Organoids: Patient in the lab Available from: https://www.huborganoids.nl (2022)
Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
. PDX Portal Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022)
Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Aggarwal, D., Russo, S., Naik, P., Bhatia, S., Spector, D. L. Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids. J. Vis. Exp. (192), e64889, doi:10.3791/64889 (2023).