Oprichting en kweek van van de patiënt afgeleide borstorganoïden

Published: February 17, 2023

doi:

Disha Aggarwal², Suzanne Russo, Payal Naik, Sonam Bhatia, David L. Spector²

¹Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, ²Genetics Graduate Program,Stony Brook University

Summary

Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt voor het vaststellen van menselijke borstorganoïden uit van de patiënt afgeleide borsttumorresecties of normaal borstweefsel. Het protocol biedt uitgebreide stapsgewijze instructies voor het kweken, bevriezen en ontdooien van menselijke patiënten afgeleide borstorganoïden.

Abstract

Borstkanker is een complexe ziekte die is ingedeeld in verschillende histologische en moleculaire subtypen. Patiënt-afgeleide borsttumor organoïden ontwikkeld in ons laboratorium bestaan uit een mix van meerdere tumor-afgeleide celpopulaties, en vertegenwoordigen dus een betere benadering van tumorceldiversiteit en -milieu dan de gevestigde 2D-kankercellijnen. Organoïden dienen als een ideaal in vitro model, waardoor cel-extracellulaire matrixinteracties mogelijk zijn, waarvan bekend is dat ze een belangrijke rol spelen in cel-celinteracties en kankerprogressie. Patiënt-afgeleide organoïden hebben ook voordelen ten opzichte van muismodellen omdat ze van menselijke oorsprong zijn. Bovendien is aangetoond dat ze de genomische, transcriptomische en metabole heterogeniteit van patiënttumoren samenvatten; Ze zijn dus in staat om tumorcomplexiteit en patiëntendiversiteit weer te geven. Als gevolg hiervan zijn ze klaar om nauwkeuriger inzicht te bieden in de ontdekking en validatie van doelen en gevoeligheidstests voor geneesmiddelen. In dit protocol geven we een gedetailleerde demonstratie van hoe patiënt-afgeleide borstorganoïden worden vastgesteld uit gereseceerde borsttumoren (kankerorganoïden) of reductief mammoplastiek-afgeleid borstweefsel (normale organoïden). Dit wordt gevolgd door een uitgebreid verslag van 3D-organoïdecultuur, expansie, passaging, bevriezing en ontdooiing van van de patiënt afgeleide borstorganoïde culturen.

Introduction

Borstkanker (BC) is de meest voorkomende maligniteit bij vrouwen, met naar schatting 287.850 nieuwe gevallen die in 2022 in de Verenigde Staten worden gediagnosticeerd¹. Ondanks de recente vooruitgang in vroege detectie met jaarlijkse screenings, gerichte therapieën en een beter begrip van genetische aanleg, is het de tweede belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker bij vrouwen in de Verenigde Staten, met > 40.000 sterfgevallen toegeschreven aan borstkanker^{per jaar 1}. Borstkanker wordt momenteel ingedeeld in meerdere subtypen op basis van histopathologische en moleculaire evaluatie van de primaire tumor. Betere subtypestratificatie heeft de patiëntresultaten verbeterd met subtypespecifieke behandelingsopties². De identificatie van HER2 als een proto-oncogen³ heeft bijvoorbeeld geleid tot de ontwikkeling van Trastuzumab, waardoor dit zeer agressieve subtype bij de meeste patiënten beheersbaar is geworden⁴. Verder onderzoek naar de genetica en transcriptomica van deze complexe ziekte op een patiëntspecifieke manier zal helpen bij het ontwikkelen en voorspellen van betere patiëntspecifieke gepersonaliseerde behandelingsregimes ^2,5. Patiënt-afgeleide organoïden (BOB’s) zijn een veelbelovend nieuw model om inzicht te krijgen in kanker op moleculair niveau, nieuwe doelen of biomarkers te identificeren en nieuwe behandelingsstrategieën te ontwerpen ^6,7,8.

BOB’s zijn meercellige, driedimensionale (3D) structuren die zijn afgeleid van vers gereseceerde primaire weefselmonsters ^8,9. Ze worden driedimensionaal gekweekt door ingebed te zijn in een hydrogelmatrix, meestal samengesteld uit een combinatie van extracellulaire matrix (ECM) -eiwitten, en kunnen daarom worden gebruikt om tumorcel-ECM-interacties te bestuderen. BOB’s vertegenwoordigen de diversiteit van de patiënt en recapituleren cellulaire heterogeniteit en genetische kenmerken van de tumor^10,11,12. Omdat het in vitro modellen zijn, maken ze genetische manipulatie en high-throughput medicijnscreenings^{mogelijk 13,14,15}. Verder kunnen BOB’s plausibel worden gebruikt om de gevoeligheid en behandelingsstrategieën van patiënten parallel aan de kliniek te evalueren en de uitkomsten van de patiënt te helpen voorspellen^16,17,18. Naast chemotherapie zijn bepaalde organoïde modellen ook gebruikt om individuele reacties van patiënten op chemoradiatie^{te onderzoeken 19,20}. Gezien de veelbelovende toepasbaarheid van BOB’s voor onderzoek en klinisch gebruik, heeft het National Cancer Institute een internationaal consortium geïnitieerd, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)²¹, om deze van tumoren afgeleide nieuwe kankermodellen te genereren en te leveren. Veel van de organoïde modellen van verschillende soorten kanker ontwikkeld via de HCMI zijn beschikbaar via de American Type Culture Collection (ATCC)²².

Van normale borstorganoïden is aangetoond dat ze bestaan uit verschillende epitheelcelpopulaties die aanwezig zijn in de borstklier ^11,23 en dienen dus als geweldige modellen om fundamentele biologische processen te bestuderen, om drivermutaties te analyseren die tumorigenese veroorzaken, en voor kankercel-van-oorsprong afstammingsstudies ^6,15 . Borsttumor organoïde modellen zijn gebruikt om nieuwe doelen te identificeren die de vooruitzichten voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën aanmoedigen, met name voor resistente tumoren^24,25,26. Met behulp van patiënt-afgeleide xenograft (PDX) en gematchte PDX-afgeleide organoïde (PDxO) modellen van behandelingsresistente borsttumoren, toonden Guillen et al. aan dat organoïden krachtige modellen zijn voor precisiegeneeskunde, die kunnen worden gebruikt om medicijnresponsen en directe therapiebeslissingen parallel te evalueren²⁸. Bovendien biedt de ontwikkeling van nieuwe co-cultuurmethoden voor het kweken van BOB’s met verschillende immuuncellen^27,28,29, fibroblasten 30,31 en microben ^32,33 een kans om de impact van de tumormicro-omgeving op kankerprogressie te bestuderen. Hoewel veel van dergelijke co-cultuurmethoden actief worden vastgesteld voor BOB’s die zijn afgeleid van pancreas- of colorectale tumoren, zijn vergelijkbare gevestigde co-cultuurmethoden voor borst-BOB’s alleen gemeld voor natural killer-cellen³⁴ en fibroblasten³⁵.

De eerste biobank van >100 patiënt-afgeleide organoïden die verschillende borstkankersubtypes vertegenwoordigen, werd ontwikkeld door de Hans Clevers-groep^36,37. Als onderdeel van deze inspanning ontwikkelde de Clevers-groep ook het eerste complexe kweekmedium voor borstorganoïdegroei, dat momenteel veel wordt gebruikt³⁶. Een vervolgstudie leverde een uitgebreid verslag op van de oprichting en kweek van borst-BOB’s en van patiënten afgeleide organoïde xenografts (PDOXs)³⁸. Het Welm-lab ontwikkelde een grote verzameling BC PDX-modellen en PDxO’s die worden gekweekt in een relatief eenvoudiger groeimedium met foetaal runderserum (FBS) en minder groeifactoren^39,40. We hebben onafhankelijk een groot aantal naïeve patiënt-afgeleide borstkanker organoïde modellen¹¹ ontwikkeld en gekarakteriseerd en hebben deelgenomen aan de ontwikkeling van BC PDO-modellen als onderdeel van het HCMI-initiatief²¹. Hier willen we een praktische gids bieden met details over de methodologie die door ons wordt gebruikt bij het genereren van patiënt-afgeleide borstorganoïde modelsystemen.

Protocol

Tumorresecties van borstkankerpatiënten, samen met het distale en aangrenzende normale weefsel, werden verkregen van Northwell Health in overeenstemming met de protocollen IRB-03-012 en IRB 20-0150 van de Institutional Review Board en met schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënten. OPMERKING: Alle onderstaande procedures werden uitgevoerd in een BSL2-kamer voor weefselkweek bij zoogdieren die was aangewezen voor patiëntmonsters na goedkeuring van het bioveiligheidscomité. Al…

Representative Results

We hebben een biobank opgezet van patiënt-afgeleide borsttumor organoïden bestaande uit verschillende subtypes11. Daarnaast hebben we meerdere normale borstorganoïde lijnen vastgesteld die zijn afgeleid van reductieve mammoplastiekweefselmonsters of aangrenzende / distale normale borst van BC-patiënten met behulp van de aanpak die is beschreven in figuur 1. De verschillende van de patiënt afgeleide organoïde lijnen van borsttumoren ve…

Discussion

Ons laboratorium heeft met succes de bovenstaande protocollen gebruikt om organoïden vast te stellen uit naïeve tumorresecties of schaafwonden. We hebben dit protocol ook gebruikt om normale organoïden te ontwikkelen uit borstweefsel verkregen via reductieve mammoplastieën of uit aangrenzend of distaal normaal borstweefsel van kankerpatiënten. Ongeveer 30%-40% van de gereseceerde primaire tumoren resulteerde in succesvolle langdurige (>passage 8) tumor organoïde culturen. De tumororganoïde lijnen die na e…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen de leden van het Spector-lab bedanken voor de kritische discussies in de loop van dit werk. We bedanken Norman Sachs en Hans Clevers (Hubrecht Instituut, Nederland) voor het in eerste instantie verstrekken van hun organoïde kweekprotocol. We erkennen de CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources voor diensten en technische expertise (NCI 2P3OCA45508). Wij danken Dr. Qing Gao voor zijn hulp bij de voorbereiding van histologische monsters. We zijn dankbaar voor de steun van Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) voor het verstrekken van tumormonsters van patiënten. We waarderen ook de inspanningen van het Northwell Health Biobanking-team voor monsterverwerving en we bedanken de patiënten en hun families voor het doneren van weefsels voor onderzoek. Dit onderzoek werd ondersteund door CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.), en Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson en D.L.S).

Materials

15 mL conical tubes	VWR	525-1068
175 cm² tissue culture flask	VWR (Corning)	29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO₂ incubator
50 mL conical tubes	VWR	525-1077
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter)	Millipore Sigma	SCGP00525	SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter	Nalgene	566-0020
6-well culture plates	Greiner Cellstar	82050-842
75 cm² tissue culture flask	VWR (Corning)	29185-304
96-well opaque plates	Corning	353296	For CTG assay
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B-27 supplement	Life Technologies	12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader	Fisher Scientific (Agilent)		For dual luciferase assay and CTG assay
BSA fraction V (7.5%)	Thermo Fisher	15260037
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent	Promega	G9683	luminescent cell viability assay
Centrifuge	Eppendorf	5804
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C5138	Type IV
Cryolabels	Amazon	DTCR-1000	Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5"
Cryovials	Simport Scientific Inc.	T311-1
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher (Gibco)	11995040
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)	Gibco	14190-144	DPBS
Epidermal growth factor (hEGF)	Peprotech	AF-100-15
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-010-CV
FGF-10 (human)	Peprotech	100-26
FGF-7/KGF (human)	Peprotech	100-19
GlutaMax	Life Technologies	35050061
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216	For TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells	R&D Systems	3710-001-01	Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPES	Life Technologies	15630-080
Heregulinβ-1 (human)	Peprotech	100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231	Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix
Mr. Frosty Cell Freezing Container	Thermo Fisher	5100-0001
Mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-418
N-acetyl-l-cysteine	Millipore Sigma	A9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher	166-0045
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636
Noggin (human)	Peprotech	120-10C
P1000, P200, P10 pipettes with tips
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190	Millipore Sigma	S7067
Parafilm			transparent film
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140122
Plasmid1: pRL-SV40P	Addgene	27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash	Addgene	12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash	Addgene	12456
pluriStrainer 200 µm	pluriSelect	43-50200-01
Primocin	Invivogen	ANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Thermo Fisher (Gibco)	12648-010	cell freezing medium
Red Blood Cell lysis buffer	Millipore Sigma	11814389001
R-spondin conditioned media	In-house or commercial from Peprotech	120-38
Scalpel (No.10)	Sklar Instruments	Jun-10
Shaker (Incu-shaker Mini)	Benchmark	H1001-M
TGF-β receptor inhibitor A 83-01	Tocris	2939
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Life Technologies	12605028	cell dissociation reagent
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent	Millipore Sigma	6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi)	Abmole Bioscience	Y-27632
Zeocin	Thermo Fisher	R25001

Referências

Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. &. #. 1. 9. 3. ;., Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Pesquisa do Câncer. , (2022).
Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
. HCMI Catalog Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022)
. Search ATCC Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022)
Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
. HUB Organoids: Patient in the lab Available from: https://www.huborganoids.nl (2022)
Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
. PDX Portal Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022)
Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Aggarwal, D., Russo, S., Naik, P., Bhatia, S., Spector, D. L. Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids. J. Vis. Exp. (192), e64889, doi:10.3791/64889 (2023).