Summary

عرض توضيحي لمقايسة ألياف الحمض النووي للتحقيق في تلف الحمض النووي وديناميكيات الإصلاح التي تسببها الجسيمات النانوية

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

تساعد المنهجية في تحليل التباين في ديناميكيات تكرار الحمض النووي في وجود الجسيمات النانوية. يمكن اعتماد منهجيات مختلفة بناء على مستوى السمية الخلوية للمادة ذات الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير وصف لتحليل الصورة للمساعدة في تحليل ألياف الحمض النووي.

Abstract

يمكن أن يسبب التعرض للمواد النانوية إجهاد النسخ المتماثل وعدم الاستقرار الجيني في الخلايا. تعتمد درجة عدم الاستقرار على كيمياء وحجم وتركيز المواد النانوية ووقت التعرض ونوع الخلية المكشوفة. وقد استخدمت عدة أساليب راسخة لتوضيح كيفية تأثير العوامل الداخلية/الخارجية على التكرار العالمي. ومع ذلك ، فإن المقايسات على مستوى replicon ، مثل مقايسة ألياف الحمض النووي ، ضرورية لفهم كيفية تأثير هذه العوامل على بدء النسخ المتماثل ، والإنهاءات ، وتطور شوكة النسخ المتماثل. إن معرفة ذلك يسمح للمرء أن يفهم بشكل أفضل كيف تزيد المواد النانوية من فرص تثبيت الطفرة وعدم الاستقرار الجينومي. استخدمنا بلاعم RAW 264.7 كخلايا نموذجية لدراسة ديناميكيات النسخ المتماثل تحت التعرض لجسيمات أكسيد الجرافين النانوية. هنا ، نوضح البروتوكول الأساسي لفحص ألياف الحمض النووي ، والذي يتضمن وضع العلامات النبضية مع نظائر النوكليوتيدات ، وتحلل الخلية ، ونشر ألياف الحمض النووي ذات العلامات النبضية على الشرائح ، والتلوين المناعي الفلوري لنظائر النوكليوتيدات داخل ألياف الحمض النووي ، وتصوير وسيطة النسخ المتماثل داخل ألياف الحمض النووي باستخدام المجهر متحد البؤر ، والتحليل الوسيط للنسخ المتماثل باستخدام برنامج التسجيل والتحليل بمساعدة الكمبيوتر (CASA).

Introduction

خلال كل دورة خلية ، يضمن تكرار الحمض النووي تكرار الجينوم بدقة1. يعتمد تكرار الكروموسومات حقيقية النواة بشكل أساسي على ثلاثة عوامل: توقيت إطلاق أصول النسخ المتماثل المتعددة ، وسرعة الشوكات التي تظهر من الأصول المطلقة ، وإنهاء عملية النسخ المتماثل عندما يلتقي شوكان متماثلان من أصول متجاورة2. من أجل نقل المعلومات الوراثية بدقة عالية إلى الخلايا الوليدة ، وكذلك الحفاظ على السلامة الوراثية ، يعد تكرار الحمض النووي بدقة أمرا بالغ الأهمية. العوامل التي تتطور من التمثيل الغذائي المنتظم أو بسبب المواد البيئية الاصطناعية أو الطبيعية تهاجم الجينوم باستمرار. تتسبب هذه العوامل الداخلية والخارجية في إبطاء أو توقف شوكات النسخ المتماثل بسبب مواجهة تلف الحمض النووي الناجم عن هذه العوامل ، وتسمى الشوكات التي تتباطأ مؤقتا أو تتوقف استجابة لهذه الصعوبات إجهاد النسخ المتماثل3. استجابة لإجهاد النسخ المتماثل ، طورت الخلايا العديد من المسارات الجزيئية التي تحافظ على استقرار شوكات النسخ المتماثل المضطربة وتسمح لها بإعادة التشغيل4. من حيث الاستقرار الجيني ، وبقاء الخلايا ، والأمراض البشرية ، ظهرت آليات الاستجابة للإجهاد المتماثل هذه كعوامل رئيسية للحفاظ على جينوم صحي ، وضمان بقاء الخلية ، وتقليل احتمالية تكوين المرض5.

أحد العوامل الخارجية القادرة على إنتاج إجهاد النسخ المتماثل هو الجسيمات النانوية. الجسيمات النانوية هي جسيمات يتراوح حجمها من 1 نانومتر إلى 100 نانومتر6. نظرا لمساحات سطحها العالية وأشكالها المميزة وخصائصها الكيميائية الفريدة ، تستخدم الجسيمات النانوية في مختلف التطبيقات الطبية والصيدلانية والبيئية والصناعية 7,8. في حين أن الجسيمات النانوية لها الكثير من الفوائد المحتملة ، فإن بعضها (بسبب طبيعتها الموروثة أو طول عمرها) يمكن أن يصبح ساما. يمكن أن تتشكل الجسيمات النانوية أيضا بسبب البلى الطبيعي للغرسات الطبية ويتم إطلاقها في المنطقة المحيطة بالأطراف الاصطناعية 9,10.

نظرا لتعرض البشر لعدد لا يحصى من الجسيمات النانوية المنتجة لتطبيقات مختلفة ، زادت الأبحاث في مجال سمية الجسيمات النانوية بشكل كبير خلال السنوات العشر الماضية11. في حين أن هذه الجهود البحثية قد كشفت عن معلومات وفيرة حول التهديد المحتمل الذي تشكله الجسيمات النانوية على صحة الإنسان ، فإن المعرفة حول إمكانية تسبب الجسيمات النانوية في السمية الجينية لا تزال محدودة. ما تم اكتشافه حتى الآن هو أن هذه الجسيمات النانوية يمكن أن تتفاعل جسديا مع الحمض النووي ، وتعزز تلف الحمض النووي ، وتتلف أو تتداخل مع البروتينات المسؤولة عن إصلاح أو تكرار الحمض النووي12. للكشف عن كيفية تداخلها مع تكرار الحمض النووي ، عادة ما يتم استخدام تمشيط ألياف الحمض النووي ، وتخليق الحمض النووي المقاوم للإشعاع (RDS) ، وتحليل ألياف الحمض النووي13،14،15،16.

طريقة تمشيط ألياف الحمض النووي مرنة وتعطي معلومات حول ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل على مستوىالجزيء الواحد 17. في جوهرها ، يتم سحب غطاء مملح برفق من محلول الحمض النووي بمجرد أن ترتبط أطراف الحمض النووي به. تستقيم جزيئات الحمض النووي (DNA) وتصطف بواسطة السطح الهلالي للمحلول. يدعم تجانس وتباعد ومحاذاة ألياف الحمض النووي قياسات دقيقة ويمكن الاعتماد عليها لطول مجرى الألياف. من خلال ضبط طول وتسلسل العلاجات والأدوية المستخدمة للتسبب في الإجهاد أو الضرر ، يمكن مراقبة العديد من جوانب تقدم الشوكة باستخدام هذا التطبيق. في هذه الطريقة ، يتم استخدام نظام وضع العلامات المزدوج ، والذي يتم من خلاله تقييم سرعة وتقدم شوكة النسخ المتماثل17,18. من ناحية أخرى ، يستفيد الرحلان الكهربائي 2D gel من حقيقة أنه في الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ، تنتقل هياكل الحمض النووي المتفرعة بشكل أبطأ من جزيئات الحمض النووي الخطية من نفس الكتلة ، مما يسمح بالفصل النظيف بين الاثنين في تشغيل 2D. في الواقع ، تم فحص هذه الطريقة لفصل جزيئات الحمض النووي بناء على كتلتها في الجولة الأولى وبناء على شكلها في الجولة الثانية المتعامدة. بعد تجزئة الحمض النووي الجينومي ، تطور المواد الوسيطة غير الشائعة للتكرار وإعادة التركيب شكلا متفرعا ، ويمكن تمييزها عن الجزيئات الخطية الأكثر شيوعا في 2D gel19.

تستخدم طريقة RDS لتحديد كيفية تأثر تخليق الحمض النووي العالمي. في هذه الطريقة ، يتم تحديد درجة تثبيط التكرار العالمي من خلال مقارنة كمية النيوكليوتيدات المدمجة ذات العلامات الإشعاعية ، مثل [14C] ثيميدين ، في الخلايا غير المعالجة مقابل الخلايا المعالجة14,20. تمثل النسبة المئوية للفرق في وضع العلامات الإشعاعية بين الخلايا غير المعالجة والمعالجة الدرجة التي يؤثر بها العامل المدمر للحمض النووي على تخليق الحمض النووي. على غرار ذلك ، تستخدم طريقة أخرى قدرة الخلايا على دمج نظائر النوكليوتيدات مثل BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) لقياس التدفق الخلوي لقياس المعدلات الإجمالية لتخليق الحمض النووي21,22. في حين أن هذه الطرق توضح كيف تؤثر العوامل الضارة بالحمض النووي على تخليق الحمض النووي العالمي ، إلا أنها لا تظهر كيف تتأثر التكرارات الفردية. في الواقع ، تعد المقايسات على مستوى replicon ضرورية لفهم أفضل لبدء ومدى عدم الاستقرار الجيني في حالة التعرض للجسيمات السامة (المواد النانوية). التصوير الشعاعي الذاتي لألياف الحمض النووي والمجهر الإلكتروني هي بعض الطرق المستخدمة لتحديد هذا23،24،25،26.

تم تطوير مفاهيم فقاعات النسخ المتماثل والنسخ المتماثل ثنائي الاتجاه من مصادر متباعدة بشكل متساو لأول مرة باستخدام اختبارات أحادية الجزيء مثل المجهر الإلكتروني والتصوير الشعاعي الذاتي لألياف الحمض النووي27,28. يتم تسهيل المراقبة المباشرة لوسيطات النسخ المتماثل المتفرعة على جزيئات محددة منتشرة عبر شبكة مغلفة بالكربون بشكل كبير بواسطة المجهر الإلكتروني. تم استخدام هذه الطريقة ، التي لا تزال قيد الاستخدام حتى اليوم لتتبع التحولات المرضية في شوكات النسخ المتماثل ، لتحديد أول أصل حقيقي النواة لتكرار الحمض النووي28. يتمحور التصوير الشعاعي الذاتي للألياف حول مفهوم التحديد الشعاعي الذاتي للمناطق المكررة حديثا ووضع علامات نبضية على الكروموسومات باستخدام الثيميدين الثلاثي. أصبح التقييم الكمي الأول لكثافات الأصل ومعدلات شوكة النسخ المتماثل في التسلسلات الجينومية الميتازوان ممكنا من خلال التصوير الشعاعي الذاتي لألياف الحمض النووي29.

حاليا ، حلت طرق التصوير الفلوري للألياف محل التصوير الشعاعي الذاتي ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن التصوير الفلوري للألياف أسرع بكثير من التصوير الشعاعي الذاتي. في التصوير الفلوري للألياف ، يتم دمج اثنين من مشتقات النوكليوتيدات المهلجنة ، مثل البرومو- (Br) أو الكلورو- (Cl) أو iododeoxyuridine (IdU) ، بالتتابع في الحمض النووي المكرر حديثا ثم يتم تحديدهما عن طريق التألق المناعي غير المباشر باستخدام الأجسام المضادة30. أصبح العرض المجهري للحمض النووي الناشئ الذي دمج أحد النظائر أو كليهما ممكنا عن طريق تلطيخ أحد النظائر بلون واحد والتناظرية الأخرى بلون مختلف (على سبيل المثال ، الحمض النووي الناشئ المناعي مع IdU الأحمر المدمج والأخضر CldU المدمج) (الشكل 1) 21. يمكن التعرف على العديد من الأنواع المختلفة من وسيطة النسخ المتماثل عن طريق تحليل ألياف الحمض النووي. الأكثر شيوعا التي تمت دراستها هي شوكات الاستطالة الفردية ، والبدء ، والإنهاءات. الشوكات الاستطالة الفردية لها نمط تكرار من اللون الأحمر متبوعا باللون الأخضر (أحمر-أخضر; الشكل 2 أ). 13 كثيرا ما تستخدم أطوال هذه المواد الوسيطة لقياس سرعة الشوكة (أي طول الشوكة / وقت النبض) أو التدهور الخارجي للحمض النووي الوليد من خلال تقصير المسار (الشكل 2E) 30،31،32. في دراسة أجراها Mimitou et al. ، وجد أنه عند التعرض طويل الأمد لهيدروكسي يوريا ، وهو سم تكرار يسبب فواصل مزدوجة في الحمض النووي ، تم تجنيد RE1133. MRE11 هو exonuclease معروف بنشاطه exonuclease 3′-5 ، وهو قادر على قطع نهايات الحمض النووي للإصلاح. لذلك ، عند التعرض للعوامل السامة ، يمكن للمرء أن يلاحظ تدهور التحلل الخارجي للحمض النووي الوليد ، وهو تقصير شريط الحمض النووي بسبب التعرض لعامل مدمر للحمض النووي34.

قد تؤدي كسور شوكة النسخ المتماثل الناتجة عن العوائق الفيزيائية (معقدات بروتين الحمض النووي أو آفات الحمض النووي) أو العوائق الكيميائية أو الطفرات إلى إيقاف النسخ المتماثل وتتطلب إعادة التركيب المتماثل لإعادة تشغيله. يعرف هذا باسم ضعف تقدم الشوكة. أشارت العديد من التحقيقات في المختبر وفي الجسم الحي إلى أن النسخ قد يمنع ، في بعض الأحيان ، تقدم شوكة النسخ المتماثل بهذه الطريقة35.

البدايات هي أصول النسخ المتماثل التي تبدأ وتطلق أثناء النبضة الأولى أو الثانية. الأصول التي تطلق أثناء النبضة الأولى ولها شوكات تكرار تستمر في النشاط لها نمط أخضر-أحمر-أخضر (الشكل 2B ، أقل). الأصول التي تبدأ خلال النبضة الثانية لها نمط أخضر فقط (الشكل 2B ، العلوي) وتسمى أحيانا الأصول التي بدأت حديثا ، لذلك يمكن تمييز هذه الأصول عن تلك التي تبدأ أثناء النبضة الأولى. تسمح مقارنة النسب المئوية النسبية للأصول التي تم إطلاقها حديثا بين حالتين تجريبيتين للمرء بفهم كيفية استجابة الخلية لعامل مدمر للحمض النووي أو وجود أو عدم وجود بروتين. يتم إنشاء الإنهاءات عندما يتم دمج شوكتين متماثلتين من replicons المجاورة ، ويكون لهما نمط أحمر-أخضر-أحمر (الشكل 2D)30.

بناء على الحقائق الموضحة أعلاه ، يعتبر تحليل ألياف الحمض النووي حاليا طريقة مفضلة لدراسة الاختلاف في ديناميكيات تكرار الحمض النووي الناجم عن العوامل السامة مثل المواد النانوية. أصبح لدى الباحثين الآن فهم ومعرفة جيدان لديناميات تكرار الحمض النووي على مستوى الجينوم في حقيقيات النوى ، من الناحيتين الكمية والنوعية ، بسبب اكتشاف هذه التكنولوجيا36. واستنادا إلى متغيرات النتائج، يمكن اعتماد عدة منهجيات. يوضح الشكل 3 بعض الأمثلة على طرق دراسة الاختلافات في تلف الحمض النووي الناجم عن العوامل الخارجية / الجسيمات النانوية. الهدف العام من طريقة تحليل ألياف الحمض النووي الموصوفة في هذه الدراسة هو تحديد كيفية تأثير الجسيمات النانوية على عملية النسخ المتماثل في المختبر وكيف تؤثر بشكل تفاضلي على الأنسجة المختلفة.

Protocol

1. إعداد الأجسام المضادة والعازلة قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأساسي ، والماوس المضاد ل BrdU عند تخفيف 1: 300 في 5٪ BSA والفئران المضادة ل BrdU عند تخفيف 1: 500 في 5٪ BSA. تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوي ، alexafluor 594 الأرنب المضاد للفأر بتخفيف 1: 300 في 5٪ BSA و alexafluor 488 دجاج مضاد للف?…

Representative Results

بعد الحصول على صور كافية (من 20-100 صورة لكل حالة) ، يجب تحديد وسيطة النسخ المتماثل وقياسها وحسابها. سواء كان تحليل الألياف يدويا أو تلقائيا عبر برنامج38 ، من الضروري تحديد الخصائص التي يجب أن تتمتع بها الألياف بوضوح حتى يتم حسابها أو تسجيلها (أو عدم حسابها أو قياسها)…

Discussion

نناقش هنا طريقة للمساعدة في تحليل التباين في ديناميكيات تضاعف الحمض النووي في وجود الجسيمات النانوية من خلال فحص ألياف الحمض النووي. يتم وصف الخطوات الحرجة الرئيسية المتضمنة في الفحص القياسي في البروتوكول (الخطوة 2.2.2 والخطوة 3.1.3). يوصى دائما باستخدام منطقة ذات تعرض محدود للضوء العلوي وتدف…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بالدعم المالي المقدم من مؤسسة Blazer ، وبرنامج التكنولوجيا الحيوية الطبية في العلوم الطبية الحيوية ، و UIC Rockford ، وقسم تعليم العلوم الصحية ، UIC Rockford. يشكر المؤلفون أنانيا سانجينيني وجيمس برادلي على مساهماتهما في المشروع.

Materials

24 well plate Fisher brand FB012929
Acetic Acid  Sigma Aldrich 695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit  Invitrogen A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat   Invitrogen A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken  Invitrogen A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse  Invitrogen A11062
BSA Sigma Aldrich A2153
CldU Sigma Aldrich 50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm) Fisher brand 12-545-EP
EDTA Fisher Scientific 15575020
Frosted Microscope Slides Fisher brand 12-550-11
Hydrochloric Acid Sigma Aldrich 320331
IdU  Sigma Aldrich 54-42-2
Methanol Fisher Scientific A454-4
Mouse Anti-BrdU  BD Biosciences 347580
Phosphate Buffer Saline Gibco 10010072
Rat anti-BrdU  Abcam BU1–75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells  ATCC TIB-71
SDS Sigma Aldrich L3771
Silane-Prep slides Sigma Aldrich S4651-72EA 
Superfrost gold plus slides Fischer scientific 22-035813
Tris pH 7.4 Sigma Aldrich 77861
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

Referências

  1. Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
  2. Gambus, A. Termination of eukaryotic replication forks. DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).
  3. Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
  4. Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
  5. Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
  6. Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
  7. Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
  8. Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
  9. Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
  10. Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
  11. Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
  12. Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
  13. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  14. Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
  15. Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , 147-155 (2013).
  16. Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
  17. Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
  18. Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
  19. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , 43-59 (2020).
  20. Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
  21. Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
  22. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  23. Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
  24. Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
  25. Brayner, R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
  27. Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
  28. Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
  29. Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Pesquisa do Câncer. 28 (9), 1810-1814 (1968).
  30. Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
  31. Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
  32. Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , (2020).
  33. Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
  34. Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
  35. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  36. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  37. Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
  38. Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
  39. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  40. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  41. Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).
check_url/pt/64903?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Patel, S., Chastain, P., Bijukumar, D. Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles. J. Vis. Exp. (193), e64903, doi:10.3791/64903 (2023).

View Video