Методология помогает в анализе вариаций динамики репликации ДНК в присутствии наночастиц. Различные методологии могут быть приняты в зависимости от уровня цитотоксичности интересующего материала. Кроме того, предоставляется описание анализа изображений, чтобы помочь в анализе волокон ДНК.
Воздействие наноматериала может вызвать репликационный стресс и геномную нестабильность в клетках. Степень нестабильности зависит от химического состава, размера и концентрации наноматериалов, времени воздействия и типа подвергшихся воздействию клеток. Несколько установленных методов были использованы для выяснения того, как эндогенные/экзогенные агенты влияют на глобальную репликацию. Тем не менее, анализы на уровне репликонов, такие как анализ ДНК-волокна, необходимы для понимания того, как эти агенты влияют на инициацию, прекращение и прогрессирование репликационной вилки. Знание этого позволяет лучше понять, как наноматериалы увеличивают шансы на фиксацию мутаций и геномную нестабильность. Мы использовали макрофаги RAW 264.7 в качестве модельных клеток для изучения динамики репликации под воздействием наночастиц оксида графена. Здесь мы демонстрируем базовый протокол анализа ДНК-волокна, который включает в себя импульсную маркировку нуклеотидными аналогами, лизис клеток, распространение меченных импульсом волокон ДНК на предметные стекла, флуоресцентное иммуноокрашивание нуклеотидных аналогов в волокнах ДНК, визуализацию репликационных промежуточных продуктов в волокнах ДНК с использованием конфокальной микроскопии и промежуточный анализ репликации с использованием программного обеспечения для компьютерной оценки и анализа (CASA).
Во время каждого клеточного цикла репликация ДНК обеспечивает точную дупликациюгенома 1. Эукариотическая хромосомная репликация по существу зависит от трех факторов: времени запуска нескольких источников репликации, скорости разветвлений, возникающих из запущенных источников, и завершения процесса репликации, когда встречаются две репликационные вилки из соседних источников2. Для высокоточной передачи генетической информации дочерним клеткам, а также для сохранения генетической целостности точная репликация ДНК имеет решающее значение. Агенты, которые развиваются в результате регулярного метаболизма или из-за искусственных или естественных материалов окружающей среды, постоянно атакуют геном. Эти эндогенные и экзогенные агенты заставляют репликационные вилки замедляться или останавливаться из-за столкновения с повреждением ДНК, вызванным этими агентами, и вилки, временно замедляющиеся или останавливающиеся в ответ на эти трудности, называются репликационным стрессом3. В ответ на репликационный стресс клетки разработали несколько молекулярных путей, которые поддерживают стабильность нарушенных репликационных вилок и позволяют им перезапуститься4. С точки зрения генетической стабильности, выживаемости клеток и болезней человека эти механизмы реакции на репликацию на стресс стали ключевыми факторами для поддержания здорового генома, обеспечения выживания клеток и снижения вероятности образования заболевания5.
Одним из экзогенных агентов, способных вызывать репликационный стресс, являются наночастицы. Наночастицы — это частицы размером от 1 нм до 100нм6. Благодаря большой площади поверхности, отличительным формам и уникальным химическим свойствам наночастицы используются в различных медицинских, фармацевтических, экологических и промышленных применениях 7,8. Хотя наночастицы имеют много потенциальных преимуществ, некоторые из них (из-за их унаследованной природы или долговечности) могут стать токсичными. Наночастицы также могут образовываться из-за естественного износа медицинских имплантатов и высвобождаться в перипротезную область 9,10.
Из-за воздействия на людей множества наночастиц, производимых для различных применений, исследования в области токсичности наночастиц значительно возросли за последние 10 лет11. Несмотря на то, что эти исследовательские усилия выявили множество информации о потенциальной угрозе, которую наночастицы представляют для здоровья человека, знания о том, что наночастицы могут вызывать генотоксичность, все еще ограничены. До сих пор было обнаружено, что эти наночастицы могут физически взаимодействовать с ДНК, способствовать повреждению ДНК и повреждать или мешать белкам, ответственным за восстановление или репликацию ДНК12. Чтобы определить, как они влияют на репликацию ДНК, обычно используют расчесывание ДНК-волокон, радиорезистентный синтез ДНК (RDS) и анализ ДНК-волокон13,14,15,16.
Метод расчесывания ДНК-волокон является гибким и дает информацию о динамике репликационной вилки на уровне одной молекулы17. По сути, засоленное покровное стекло осторожно извлекается из раствора ДНК, как только концы ДНК связываются с ним. Молекулы ДНК выпрямляются и выравниваются мениском раствора. Однородность, расстояние и выравнивание волокон ДНК поддерживают точные и надежные измерения длины волоконного тракта. Регулируя продолжительность и последовательность процедур и лекарств, используемых для вызова стресса или повреждения, с помощью этого приложения можно контролировать многие аспекты продвижения вилки. В этом методе используется система двойной маркировки, с помощью которой оценивается скорость и прогрессия репликационной вилки17,18. С другой стороны, 2D-гель-электрофорез использует тот факт, что при электрофорезе в агарозном геле ветвящиеся структуры ДНК движутся медленнее, чем линейные молекулы ДНК той же массы, что позволяет полностью разделить их в 2D-прогоне. Фактически, этот метод исследуется для разделения молекул ДНК на основе их массы в первом прогоне и на основе их формы во втором ортогональном прогоне. После фрагментации геномной ДНК необычные промежуточные продукты репликации и рекомбинации развивают ветвящуюся форму, и их можно отличить от более распространенных линейных молекул в 2D-геле19.
Метод RDS используется для определения того, как это влияет на глобальный синтез ДНК. В этом методе степень ингибирования глобальной репликации определяют путем сравнения количества включенных радиоактивно меченных нуклеотидов, таких как [14C]тимидин, в необработанных клетках и обработанныхклетках 14,20. Процентная разница в радиоактивной мечке между необработанными и обработанными клетками представляет собой степень, в которой повреждающий ДНК агент влияет на синтез ДНК. Подобно этому, другой метод использует способность клеток интегрировать нуклеотидные аналоги, такие как BrdU (5-бром-2′-дезоксиуридин) для проточной цитометрии для измерения общих скоростей синтеза ДНК21,22. Хотя эти методы демонстрируют, как агенты, повреждающие ДНК, влияют на глобальный синтез ДНК, они не показывают, как это влияет на отдельные репликоны. Действительно, анализы на уровне репликонов необходимы для лучшего понимания инициации и степени геномной нестабильности в случае воздействия токсичных частиц (наноматериалов). Авторадиография ДНК-волокна и электронная микроскопия – вот некоторые методы, используемые для определения этого23,24,25,26.
Концепции репликационных пузырьков и двунаправленной репликации из неравномерно расположенных источников были впервые разработаны с использованием одномолекулярных тестов, таких как электронная микроскопия и авторадиография ДНК-волокна27,28. Прямое наблюдение ветвящихся репликационных промежуточных продуктов на конкретных молекулах, диспергированных по сетке с углеродным покрытием, значительно облегчается электронной микроскопией. Этот метод, который до сих пор используется для отслеживания патологических сдвигов в репликационных вилках, был использован для определения первого эукариотического происхождения репликации ДНК28. Волоконная авторадиография сосредоточена вокруг концепции авторадиографической идентификации вновь реплицированных участков и импульсного мечения хромосом тритированным тимидином. Первая количественная оценка плотности происхождения и скорости репликационных вилок в геномных последовательностях многоклеточных стало возможным благодаря авторадиографии ДНК-волокна29.
В настоящее время методы волоконной флюорографии заняли место ауторадиографии, главным образом потому, что волоконная флюорография намного быстрее, чем авторентгенография. При волоконной флюорографии два галогенированных производных нуклеотидов, такие как бром- (Br), хлор- (Cl) или йоддезоксиуридин (IdU), последовательно включаются в свежереплицированную ДНК, а затем идентифицируются путем непрямой иммунофлюоресценции с использованием антител30. Микроскопическое наблюдение зарождающейся ДНК, которая включает один или оба аналога, стало возможным благодаря иммуноокрашиванию одного из аналогов в один цвет, а другого аналога в другой цвет (например, иммуноокрашивание зарождающейся ДНК с включенным красным IdU и включенным зеленым CldU) (рис. 1)21. Многие различные типы репликационных промежуточных продуктов могут быть идентифицированы с помощью анализа волокон ДНК. Наиболее часто изучаются отдельные удлиняющиеся вилки, инициации и окончания. Отдельные удлиняющиеся вилки имеют узор репликации красного цвета, за которым следует зеленый (красно-зеленый; Рисунок 2А). 13 Длины этих промежуточных продуктов часто используются для измерения скорости вилки (т.е. длины вилки/времени импульса) или экзонуклеолитической деградации зарождающейся ДНК за счет укорочения трека (рис. 2E)30,31,32. В исследовании, проведенном Mimitou et al., было обнаружено, что при длительном воздействии гидроксимочевины, репликационного яда, вызывающего двухцепочечные разрывы в ДНК, RE11 был набран33. MRE11 представляет собой экзонуклеазу, известную своей экзонуклеазной активностью 3′-5′, и она способна разрезать концы ДНК для репарации. Следовательно, при воздействии токсических агентов можно наблюдать экзонуклеолитическую деградацию зарождающейся ДНК, которая представляет собой укорочение цепи ДНК из-за воздействия повреждающего ДНК агента34.
Разрывы репликационной вилки, вызванные физическими препятствиями (ДНК-белковые комплексы или повреждения ДНК), химическими препятствиями или мутациями, могут остановить репликацию и потребовать гомологичной рекомбинации для ее возобновления. Это известно как нарушение прогрессирования вилки. Многочисленные исследования in vitro и in vivo показали, что транскрипция может иногда предотвращать развитие репликационной вилки таким образом35.
Инициации – это источники репликации, которые инициируются и срабатывают во время первого или второго импульса. Источники, которые срабатывают во время первого импульса и имеют репликационные вилки, которые продолжают быть активными, имеют зелено-красно-зеленый паттерн (рис. 2B, ниже). Источники, которые инициируются во время второго импульса, имеют только зеленый паттерн (рис. 2B, вверху) и иногда называются вновь инициированными источниками, поэтому эти источники можно отличить от тех, которые инициируются во время первого импульса. Сравнение относительного процента новых источников между двумя экспериментальными условиями позволяет понять, как клетка реагирует на агент, повреждающий ДНК, или наличие или отсутствие белка. Терминации создаются, когда две репликационные вилки из соседних репликонов сливаются, и они имеют красно-зелено-красный паттерн (рис. 2D)30.
Основываясь на фактах, описанных выше, анализ ДНК-волокна в настоящее время считается предпочтительным методом изучения изменений в динамике репликации ДНК, вызванных токсичными агентами, такими как наноматериалы. Исследователи теперь хорошо понимают и знают динамику полногеномной репликации ДНК у эукариот, как количественно, так и качественно, благодаря открытию этой технологии36. На основе переменных результатов может быть принято несколько методологий. Некоторые примеры методов изучения вариаций повреждений ДНК, вызванных внешними агентами/наночастицами, показаны на рисунке 3. Общая цель метода анализа ДНК-волокна, описанного в этом исследовании, состоит в том, чтобы определить, как наночастицы влияют на процесс репликации in vitro и как они по-разному влияют на различные ткани.
Здесь мы обсуждаем метод, помогающий в анализе вариаций динамики репликации ДНК в присутствии наночастиц с помощью анализа волокна ДНК. Основные критические этапы, связанные со стандартным анализом, описаны в протоколе (этап 2.2.2 и этап 3.1.3). Всегда рекомендуется использовать область с о…
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают признательность за финансовую поддержку со стороны Фонда Блейзера, Программы медицинской биотехнологии в Биомедицинских науках, UIC Rockford, и Департамента образования в области медицинских наук, UIC Rockford. Авторы благодарят Ананью Сангинени и Джеймса Брэдли за их вклад в проект.
24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
Rat anti-BrdU | Abcam | BU1–75(ICR1) | |
Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |