यहाँ प्रस्तुत तरीके विदारक के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान कर रहे हैं, dissociating, संवर्धन, और भीतरी कान के वेस्टिबुलर नाड़ीग्रन्थि और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स से पैच-दबाना रिकॉर्डिंग.
पृथक और सुसंस्कृत आंतरिक कान नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की कॉम्पैक्ट आकृति विज्ञान आयन चैनलों और न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है जो इस आबादी में सेल विविधता में योगदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के उद्देश्य से आंतरिक कान द्विध्रुवी न्यूरॉन्स के सोमाता के सफल विदारक, पृथक्करण और अल्पकालिक संवर्धन के लिए आवश्यक चरणों की रूपरेखा तैयार करता है। वेस्टिबुलर गैंग्लियन न्यूरॉन्स तैयार करने के लिए विस्तृत निर्देश सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स चढ़ाना के लिए आवश्यक आवश्यक संशोधनों के साथ प्रदान किए जाते हैं। प्रोटोकॉल में छिद्रित-पैच कॉन्फ़िगरेशन में पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग करने के निर्देश शामिल हैं। हाइपरपोलराइजेशन-सक्रिय चक्रीय न्यूक्लियोटाइड-गेटेड (एचसीएन) -मध्यस्थता धाराओं के वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग की विशेषता वाले उदाहरण परिणाम अधिक मानक टूट-पैच कॉन्फ़िगरेशन की तुलना में छिद्रित-पैच रिकॉर्डिंग कॉन्फ़िगरेशन की स्थिरता को उजागर करते हैं। इन विधियों का संयोजन, पृथक सोमाता प्लस छिद्रित-पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग, का उपयोग सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिनके लिए लंबी, स्थिर रिकॉर्डिंग और इंट्रासेल्युलर मील के संरक्षण की आवश्यकता होती है, जैसे कि जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स के माध्यम से सिग्नलिंग।
वेस्टिबुलोकोक्लियर तंत्रिका के द्विध्रुवी न्यूरॉन्स आंतरिक कान की संवेदी बाल कोशिकाओं को ब्रेनस्टेम से जोड़ते हैं। वे ध्वनि और सिर आंदोलनों के बारे में जानकारी के प्रमुख वाहक हैं; इन महत्वपूर्ण कोशिकाओं को नुकसान से बहरापन और संतुलन विकार होता है। तंत्रिका के वेस्टिबुलर और श्रवण भागों में प्रत्येक अलग-अलग सेल प्रकार शामिल होते हैं जो रूपात्मक और कार्यात्मक रूप से विविध 1,2 होते हैं। वेस्टिबुलर प्रणाली में, दो अभिवाही उप-जनसंख्या अंतराल पर अनायास आग लगाते हैं जो या तो नियमित या अनियमित होते हैं2. अभिवाही स्पाइक समय आयन चैनल संरचना 3,4 में एक अंतर्निहित विविधता को प्रतिबिंबित करने के लिए सोचा है. श्रवण प्रणाली में, सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स (एसजीएन) के दो मुख्य उप-जनसंख्या हैं; जबकि टाइप I SGN व्यक्तिगत आंतरिक बाल कोशिकाओं से संपर्क करते हैं5, टाइप II SGN कई बाहरी बाल कोशिकाओं से संपर्क करतेहैं 5. अर्ध-बरकरार और organotypic संस्कृतियों से इन विट्रो रिकॉर्डिंग प्रकार मैं और प्रकार द्वितीय SGNs 6,7 की झिल्ली गुणों में अंतर का सुझाव.
इन न्यूरॉन्स के टर्मिनलों पर पाए जाने वाले कई आयन चैनल और न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स भी उनके सेल बॉडी में पाए जाते हैं। जैसे, पृथक वेस्टिबुलर और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि सोमाटा की संस्कृतियों का अध्ययन इन विट्रो में किया जा सकता है ताकि यह समझा जा सके कि आयन चैनल और न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स इन न्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया में कैसे योगदान करते हैं। पृथक सेल निकायों की कॉम्पैक्ट आकृति विज्ञान उच्च गुणवत्ता वाली विद्युत रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है, जो वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों और न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त है। न्यूरॉन उपप्रकारों की एक प्रतिनिधि किस्म के लिए आसान पहुँच सेल विविधता के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।
यह लेख प्रसवोत्तर दिन (पी) 9 से पी 20 में चूहों में वेस्टिबुलर गैंग्लियन के बेहतर हिस्से से अलग नाड़ीग्रन्थि सेल निकायों को अलग करने और संवर्धन के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को सफलतापूर्वक निकालने, अलग करने और चढ़ाना के लिए आवश्यक चरणों के अलावा, सर्पिल नाड़ीग्रन्थि के लिए इन तरीकों का विस्तार करने के लिए सुझाव भी प्रदान किए जाते हैं। ये विधियां विभिन्न प्रयोगशालाओं 8,9,10 के प्रकाशनों में तैयार किए गए लोगों का एक विकास हैं। इसके अलावा इस पत्र में शामिल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए स्वस्थ कोशिकाओं का चयन करने के लिए मार्गदर्शन है.
अंत में, प्रोटोकॉल छिद्रित पैच विन्यास11 का उपयोग कर पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के लिए प्रक्रिया की रूपरेखा. हालांकि छिद्रित-पैच कॉन्फ़िगरेशन अधिक समय लेने वाली और अधिक सामान्य टूट-पैच कॉन्फ़िगरेशन की तुलना में अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, यह साइटोप्लाज्मिक परिवेश को बनाए रखने के लिए बेहतर है जो लंबे और स्थिर रिकॉर्डिंग सत्रों की अनुमति देता है। इस रिकॉर्डिंग विन्यास के लाभों को टूट-पैच रिकॉर्डिंग के सापेक्ष छिद्रित-पैच में हाइपरपोलराइजेशन सक्रिय धनायनित धाराओं की बेहतर स्थिरता के माध्यम से यहां चित्रित किया गया है।
इस प्रोटोकॉल को पांच खंडों में व्यवस्थित किया गया है। अनुभाग 1-3 उन समाधानों और उपकरणों का वर्णन करते हैं जिन्हें समय से पहले तैयार और संग्रहीत किया जा सकता है। धारा 4 विदारक और वेस्टिबुलर और SGN चढ़ाना के लिए चरणों का वर्णन करता है. धारा 5 संस्कृति में एक अवधि के बाद न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए चरणों का वर्णन करता है. हमारे हाथों में, धारा 4 और धारा 5 लगातार 2 दिनों की अवधि में किए जाते हैं।
यहां प्रस्तुत विधियां पृथक न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए विशिष्ट हैं; पिछले अध्ययनों ने अर्ध-बरकरार तैयारी में एक्सॉन टर्मिनलों से रिकॉर्डिंग पर ध्यान केंद्रित किया है। जब मौजूदा टर्मिनल रिकॉर्डि…
The authors have nothing to disclose.
हम इन विधियों में उनके शुरुआती योगदान के लिए डॉ. जिंग बिंग जू और रूथ ऐनी ईटॉक को स्वीकार करते हैं। इस काम को NIH NIDCD R03 DC012652 और NIH NIDCD DC012653S, और R01 DC0155512 से RK और T32 DC009975 से DB, NN और KR द्वारा समर्थित किया गया था।
Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
Bunsen burner | |||
CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
DMSO | Biotium | 90082 | |
Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
Parafilm | Bemis | PM992 | |
Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
Vortex | VWR | 945300 | |
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |