Patch-Clamp 기록을 위해 신생아 설치류에서 전정 및 나선형 신경절 소마타를 분리 및 배양합니다.
Summary
여기에 제시된 방법은 내이의 전정 신경절 및 나선형 신경절 뉴런에서 해부, 해리, 배양 및 패치 클램프 기록에 대한 자세한 지침을 제공합니다.
Abstract
분리되고 배양된 내이 신경절 뉴런의 조밀한 형태는 이 집단의 세포 다양성에 기여하는 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체의 상세한 특성을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 패치 클램프 기록을 위해 내이 양극성 뉴런의 소마타를 성공적으로 해부, 해리 및 단기 배양하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다. 전정신경절 뉴런을 준비하기 위한 자세한 지침은 나선형 신경절 뉴런을 도금하는 데 필요한 수정과 함께 제공됩니다. 이 프로토콜에는 천공 패치 구성에서 전체 셀 패치 클램프 기록을 수행하기 위한 지침이 포함되어 있습니다. 과분극 활성화 순환 뉴클레오티드 개폐(HCN) 매개 전류의 전압 클램프 기록을 특성화하는 예제 결과는 보다 표준적인 파열 패치 구성과 비교하여 천공 패치 기록 구성의 안정성을 강조합니다. 이러한 방법의 조합인 분리된 소마타와 천공된 패치 클램프 기록은 길고 안정적인 기록과 G-단백질 결합 수용체를 통한 신호 전달과 같은 세포 내 환경의 보존이 필요한 세포 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
전정 신경의 양극성 뉴런은 내이의 감각 유모 세포를 뇌간에 연결합니다. 그들은 소리와 머리 움직임에 대한 정보의 주요 운반자입니다. 이러한 중요한 세포가 손상되면 난청과 균형 장애가 발생합니다. 신경의 전정 및 청각 부분은 각각 형태학적으로나 기능적으로 다양한 뚜렷한 세포 유형으로 구성되어 있습니다 1,2. 전정계(vestibular system)에서는 두 개의 구심성 하위집단(afferent subpopulation)이 규칙적이거나 불규칙한 간격으로 자발적으로 발화한다2. 구심성 스파이크 타이밍은 이온 채널 조성 3,4의 근본적인 다양성을 반영하는 것으로 생각됩니다. 청각 시스템에는 나선형 신경절 뉴런(SGN)의 두 가지 주요 하위 집단이 있습니다. 반면, I형 SGN은 개별적인 내모세포5와 접촉하는 반면, II형 SGN은 다수의 외유모세포5와 접촉한다. 반원형 및 유기형 배양에서 얻은 시험관 내 기록은 유형 I 및 유형 II SGN의 막 특성의 차이를 시사합니다 6,7.
이러한 뉴런의 말단에서 발견되는 많은 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체는 세포체에서도 발견됩니다. 따라서 고립된 전정 및 나선형 신경절 소마타의 배양은 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체가 이러한 뉴런의 반응에 어떻게 기여하는지 이해하기 위해 시험관 내에서 연구할 수 있습니다. 분리된 세포체의 조밀한 형태는 고품질 전기 기록이 가능하며, 전압 개폐 이온 채널 및 신경 전달 물질 수용체의 상세한 특성 분석에 적합합니다. 대표적인 다양한 뉴런 아형에 쉽게 접근할 수 있어 세포 다양성에 대한 고처리량 분석이 가능합니다.
이 논문은 출생 후 (P)9에서 P20까지 쥐의 전정 신경절의 상부에서 해리된 신경절 세포체를 분리하고 배양하는 방법을 제시합니다. 또한 이러한 방법을 나선형 신경절로 확장하기 위한 제안과 함께 신경절 세포를 성공적으로 추출, 해리 및 도금하는 데 필요한 단계가 제공됩니다. 이러한 방법은 다양한 실험실 8,9,10의 간행물에서 고안된 방법의 진화입니다. 또한 이 문서에는 패치 클램프 기록을 위한 건강한 세포를 선택하기 위한 지침이 포함되어 있습니다.
마지막으로, 프로토콜은 천공-패치 구성(perforated-patch configuration)(11)을 이용한 패치-클램프 기록에 대한 절차를 개략적으로 설명한다. 천공 패치 구성은 일반적인 파열 패치 구성보다 시간이 많이 걸리고 기술적으로 더 까다롭지만 길고 안정적인 기록 세션을 허용하는 세포질 환경을 유지하는 데 더 좋습니다. 이 기록 구성의 이점은 파열 패치 기록에 비해 천공 패치에서 과분극 활성화 양이온 전류의 향상된 안정성을 통해 설명됩니다.
이 프로토콜은 5개의 섹션으로 구성되어 있습니다. 섹션 1-3에서는 미리 준비하고 저장할 수 있는 솔루션과 도구에 대해 설명합니다. 섹션 4는 전정 및 SGN을 해부하고 도금하는 단계를 설명합니다. 섹션 5는 배양 기간 후 뉴런에서 기록하는 단계를 설명합니다. 우리 손에서 섹션 4와 섹션 5는 연속 2 일 동안 수행됩니다.
Protocol
여기에 설명된 모든 동물 사용은 University of Southern California의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜의 동물은 Charles River Laboratories에서 얻은 남녀 모두의 P3 내지 P25 연령의 Long Evans 쥐이지만, 이러한 방법은 다른 설치류 균주에 적용될 수 있습니다. 모든 절차 중에 실험실 가운과 장갑을 착용해야 하며 용액을 만들 때는 물 튀김 방지 고글을 착용해야 합니다. <p class=…
Representative Results
전압 단계 제품군을 적용하여 전압 클램프 프로토콜을 실행하면 다양한 전류 제품군의 전압 종속 활성화를 알 수 있습니다. VGN으로부터 유발되고 공개된 기록(13)으로부터 적응된 전체 셀 전류의 대표적인 예들이 도 1A,B에 도시되어 있다. 탈분극 전압을 적용하면(그림 1B) 매우 빠르게 활성화 및 비활성화되는 내부 전류(일…
Discussion
여기에 제시된 방법은 고립된 뉴런의 기록에 특화되어 있습니다. 이전 연구는 반온전한 준비에서 축삭 말단의 기록에 중점을 두었습니다. 기존 터미널 기록 기술과 비교할 때 절연 기록은 우수한 공간 클램프 및 등전위 동작을 제공합니다. 또한, 이 프로토콜은 전정 상피의 반온전한 기록에서 꽃받침을 함유한 하위 집단만 접근할 수 있기 때문에 더 광범위한 뉴런 샘플에 대한 접근을 제공합니다….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이러한 방법에 대한 초기 기여에 대해 Jing Bing Xue 박사와 Ruth Anne Eatock 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH NIDCD R03 DC012652 및 NIH NIDCD DC012653S, R01 DC0155512 RK 및 T32 DC009975 DB, NN 및 KR의 지원을 받았습니다.
Materials
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
Referências
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Citar este artigo
Iyer, M. R., Ventura, C., Bronson, D., Nowak, N., Regalado, K., Kalluri, R. Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (194), e64908, doi:10.3791/64908 (2023).