पुरुष एसडी चूहों में स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन-प्रेरित मधुमेह घाव मॉडल वर्तमान में टाइप 1 मधुमेह मेलेटस में घाव भरने का अध्ययन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है। यह प्रोटोकॉल इस मॉडल के निर्माण के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों का वर्णन करता है। यह संभावित चुनौतियों को भी प्रस्तुत करता है और संबोधित करता है और मधुमेह के घावों की प्रगति और एंजियोजेनिक विशेषताओं की जांच करता है।
स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन इंजेक्शन की एक उच्च खुराक के बाद चूहों के डोरसम पर पूर्ण मोटाई वाली त्वचा छांटना टाइप 1 मधुमेह के घावों के पशु मॉडल के निर्माण के लिए एक सामान्य तरीका है। हालांकि, अनुचित हेरफेर चूहों में मॉडल अस्थिरता और उच्च मृत्यु दर का कारण बन सकता है। दुर्भाग्य से, टाइप 1 मधुमेह घाव मॉडलिंग पर कुछ मौजूदा दिशानिर्देश हैं, और उनमें विस्तार की कमी है और विशिष्ट संदर्भ रणनीतियों को प्रस्तुत नहीं करते हैं। इसलिए, यह प्रोटोकॉल टाइप 1 मधुमेह घाव मॉडल के निर्माण के लिए पूरी प्रक्रिया का विवरण देता है और मधुमेह के घावों की प्रगति और एंजियोजेनिक विशेषताओं का विश्लेषण करता है। टाइप 1 मधुमेह घाव मॉडलिंग में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन इंजेक्शन की तैयारी, टाइप 1 मधुमेह मेलेटस का प्रेरण, और घाव मॉडल का निर्माण। घाव के बाद 7 वें और 14 वें दिन घाव क्षेत्र को मापा गया था, और चूहों की त्वचा के ऊतकों को हिस्टोपैथोलॉजिकल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए निकाला गया था। परिणामों से पता चला है कि टाइप 1 मधुमेह मेलेटस 55 मिलीग्राम / किग्रा स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन द्वारा प्रेरित था जो कम मृत्यु दर और उच्च सफलता दर से जुड़ा था। प्रेरण के 5 सप्ताह के बाद रक्त शर्करा का स्तर अपेक्षाकृत स्थिर था। मधुमेह के घाव भरने की दर 7 वें और 14 वें दिन (पी < 0.05) पर सामान्य घावों की तुलना में काफी कम थी, लेकिन दोनों 14 वें दिन 90% से अधिक तक पहुंच सकते थे। सामान्य समूह की तुलना में, 14 वें दिन मधुमेह के घावों की एपिडर्मल परत बंद होना अधूरा था और इससे पुन: उपकलाकरण में देरी हुई और एंजियोजेनेसिस में काफी कमी आई (पी < 0.01)। इस प्रोटोकॉल के आधार पर निर्मित टाइप 1 मधुमेह घाव मॉडल में पुरानी घाव भरने की विशेषताएं हैं, जिसमें खराब बंद होना, पुन: उपकलाकरण में देरी और सामान्य चूहे के घावों की तुलना में एंजियोजेनेसिस में कमी शामिल है।
टाइप 1 मधुमेह मेलेटस (टी 1 डीएम) एक पुरानी चयापचय बीमारी है जो हाइपरग्लेसेमिया और अग्नाशय ीβ-कोशिकाओं के विनाश की विशेषता है। एक टी 1 डीएम घाव एक पुरानी गैर-उपचार घाव है और मनुष्यों में मधुमेह की सबसे आम और विनाशकारी जटिलता 2,3 है। पशु मॉडल घाव भरने के दौरान पैथोलॉजिकल परिवर्तनों और संभावितचिकित्सीय एजेंटों की सुरक्षा और प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त प्रोटोटाइप हैं। अन्य प्रकारों की तुलना में, नर स्प्राग-डॉवले (एसडी) चूहे स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन (एसटीजेड) के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं और कम संबंधित मृत्यु दर दिखाते हैं, जिससे वे मधुमेहघाव अनुसंधान 5,6 में लोकप्रिय हो जाते हैं।
टी 1 डीएम घाव मॉडल के निर्माण के लिए कई तरीकों का वर्णन किया गया है। टी 1 डीएम मॉडल के बारे में, अध्ययनों ने मुख्य रूप से मधुमेह प्रेरण 7,8 की सफलता दर पर एसटीजेड इंजेक्शन विधि के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, मॉडलिंग प्रक्रिया इस ही चरण के असंगत संचालन से ग्रस्त है। एक अध्ययन में, चूहों ने एसटीजेड इंजेक्शन से पहले 18 घंटे तक उपवास किया; एसटीजेड इंजेक्शन के 1 सप्ताह बाद 16.67 mmol / L से अधिक रक्त शर्करा के स्तर वाले चूहों को मधुमेह माना जाता था, और मधुमेह के घाव को 3 सप्ताह9 के बाद पेश किया गया था। इसके विपरीत, एक संबंधित अध्ययन में, झू एट अल ने एसटीजेड इंजेक्शन से पहले 12 घंटे के लिए चूहों को उपवास किया; इंजेक्शन के बाद 72 घंटे में 16.7 mmol / L से अधिक रक्त शर्करा के स्तर वाले चूहों को मधुमेह माना जाता था, और मधुमेह के घाव को 4 सप्ताह10 के बाद पेश किया गया था। कुल मिलाकर, एसटीजेड इंजेक्शन प्रोटोकॉल, मधुमेह निदान मानदंड और घाव परिचय समय में विसंगतियां हैं।
घाव मॉडलिंग के संदर्भ में, अधिकांश अध्ययनों में, पृष्ठीय त्वचा की पूरी मोटाई को सफल मधुमेह प्रेरण11,12,13 के बाद टी 1 डीएम घावों के निर्माण के लिए उत्पादित किया जाता है। यद्यपि यह मॉडल चूहों में त्वचा के संकुचन के लिए अतिसंवेदनशील है, यह घाव भरने के अनुसंधान में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है क्योंकि यह कम श्रम-गहन है और सस्ता14,15 है। फिर भी, इस पूर्ण मोटाई वाले छांटने की तकनीक पर विधि-निर्देशित अनुसंधान की कमी है। इसके अलावा, घाव के आकार और स्थान12,16 के बारे में मौजूदा अध्ययनों में कोई समान मानक नहीं हैं। घाव का आकार और स्थान अप्रत्यक्ष रूप से प्रयोगात्मक डिजाइन की स्थिरता और परिणामों की वैज्ञानिक वैधता को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, शोधकर्ताओं के लिए संदर्भ के रूप में टी 1 डीएम प्रेरण और घाव मॉडलिंग के लिए एक मानक प्रोटोकॉल की तत्काल आवश्यकता है। इस अध्ययन का लक्ष्य टी 1 डीएम घाव मॉडलिंग के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल की कल्पना करना है जिसे टी 1 डीएम घाव अध्ययन के लिए संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल टी 1 डीएम घाव मॉडलिंग में विवादित संचालन को स्पष्ट करता है। एसटीजेड इंजेक्शन प्रोटोकॉल, टी 1 डीएम प्रेरण सफलता मानदंड, रक्त ग्लूकोज स्थिरीकरण समय, और घाव स्थान और आकार पर चिंताओं को इस काम में संबोधित किया गया है। इसके अलावा, टी 1 डीएम घाव भरने के मूल्यांकन के लिए पैथोलॉजिकल विशेषताओं और मापने योग्य मापदंडों को स्पष्ट किया गया है।
चूहों ने एसटीजेड इंजेक्शन से पहले 18 घंटे तक उपवास किया ताकि ग्लूकोज या β-कोशिकाओं के लिए इसके एनालॉग के प्रतिस्पर्धी बंधन से बचा जा सके, जो एसटीजेड की प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकता है। टी 1 डीएम को प्रेरित करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि एसटीजेड की एक उच्च खुराक है, जो आइलेट्स को नुकसान पहुंचाकर और इंसुलिन स्राव को कम करके रक्त शर्कराको बढ़ाती है। पूर्व-प्रायोगिक परीक्षणों से पता चला कि उच्च सफलता दर और कम मृत्यु दर के लिए इष्टतम एसटीजेड खुराक 55 मिलीग्राम / किग्रा थी, जो पिछले अध्ययनों में रिपोर्ट की गई इष्टतम खुराक22,23,24 से कम है। इस प्रोटोकॉल में, टी 1 डीएम को 55 मिलीग्राम / किग्रा एसटीजेड के एकल इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग करके प्रेरित किया गया था।
एसटीजेड इंजेक्शन के 3 दिन बाद रक्त शर्करा का स्तर 16.7 mmol / L से अधिक था। हालांकि, एसटीजेड इंजेक्शन के बाद 7 वें दिन 16.7 mmol / L से अधिक रक्त शर्करा का स्तर सफल T1DM मॉडलिंग के लिए अनुशंसित मानदंड है, क्योंकि आइलेट क्षति की सीमा चूहों के बीच भिन्न होती है, और नैदानिक समय का उचित विस्तार झूठी-नकारात्मक दर को कम कर सकता है। इसके अलावा, एसटीजेड इंजेक्शन के 5 सप्ताह बाद रक्त शर्करा में उतार-चढ़ाव स्थिर हो गया, और चूहों ने इस अवधि के दौरान धीरे-धीरे वजन बढ़ाया, पिछले निष्कर्षों25,26 के अनुरूप। यह इंगित करता है कि टी 1 डीएम मॉडल में रक्त शर्करा के स्तर को कम से कम 6 सप्ताह तक स्थिर किया जाना चाहिए, और 6 सप्ताह के बाद चूहे के वजन में वृद्धि घाव मॉडलिंग के दौरान मृत्यु दर को कम करती है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल ने एसटीजेड इंजेक्शन के 8 सप्ताह बाद घाव मॉडलिंग का आयोजन किया।
घाव लगने के बाद 7 वें और 14 वें दिन घाव बंद होने की दर सामान्य घाव समूह की तुलना में मधुमेह में काफी कम थी, जो धीमी गति से उपचार का संकेत देती है। इसके अलावा, सामान्य समूह की तुलना में मधुमेह में घाव पुन: उपकलाकरण और एंजियोजेनेसिस काफी कम थे। यह दर्शाता है कि टी 1 डीएम घाव मॉडल सामान्य चूहों की तुलना में धीमी घाव भरने और पुन: उपकलाकरण में देरी दिखाता है, जो कम घाव एंजियोजेनेसिस के रोग संबंधी परिवर्तनों से संबंधित हो सकता है। हालांकि, 14 वें दिन, टी 1 डीएम घाव भरने की दर भी 90% से ऊपर थी, जो मानव मधुमेह के घावों की पुरानी गैर-चिकित्सा विशेषता से अलग है। ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि घाव भरने के लिए कृन्तकों के शारीरिकतंत्र मनुष्यों से भिन्न होते हैं। नतीजतन, सबसे अच्छा घाव व्यास कम से कम 20 मिमी है, जो मधुमेह के घाव के अध्ययन में हस्तक्षेप की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए समय देने के लिए पर्याप्त बड़ा है। घाव के स्थान को स्कैपुला और रीढ़ की हड्डी से बचना चाहिए, क्योंकि इन दो साइटों में निरंतर गति घाव भरने में बाधा डाल सकती है।
अंत में, इस प्रोटोकॉल की विधि का उपयोग करके टी 1 डीएम घाव मॉडल का निर्माण प्रभावी है। प्रोटोकॉल क्रोनिक मधुमेह के घावों की कुछ विशेषताओं को दोहराता है, जैसे कि धीमी गति से घाव भरने, पुन: उपकला में देरी, और सामान्य चूहे के घावों की तुलना में एंजियोजेनेसिस में कमी। हालांकि, यह अज्ञात है कि क्या मॉडल मधुमेह के घावों के अन्य पुराने फेनोटाइप को दोहरा सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल सबसे मौलिक और व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि का वर्णन करता है, जो चूहों में त्वचा के संकुचन के मुद्दे के लिए जिम्मेदार नहीं है। भविष्य के शोध इस प्रोटोकॉल में घाव स्प्लिंट्स के उपयोग को शामिल कर सकते हैं या पुराने मधुमेह के घावों के अतिरिक्त मॉडल का पता लगा सकते हैं, जो भविष्य में शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती होगी।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82104877) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।
Antifade mounting medium | Southern Biotechnology Associates, Inc. | 0100-01 | |
AutoFluo Quencher | Servicebio Technology co., Ltd. | G1221 | |
Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific Inc. | Varistain™ Gemini ES | |
CD31 | Servicebio Technology co., Ltd. | GB11063-2 | |
Citrate antigen retrieval solution | Servicebio Technology co., Ltd. | G1201 | |
Cover glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 10212432C | |
DAPI | Servicebio Technology co., Ltd. | G1012 | |
Decolorization shaker | Scilogex | S1010E | |
Depilatory cream | Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd. | — | |
Dimethyl benzene | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 64-17-5 | |
Drug oscillator | Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. | VM-370 | |
Electric razor | Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. | FC5908 | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | |
Ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 1330-20-7 | |
Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG | Servicebio Technology co., Ltd. | GB22303 | |
Goat serum | Thermo Fisher Scientific Inc. | 16210064 | |
Hematoxylin and eosin staining solution | Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. | DH0020 | |
Image J software | National Institutes of Health | — | |
Microwave oven | Midea Group Co., Ltd. | M1-L213B | |
Mini centrifuge | Scilogex | D1008 | |
Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
Portable blood glucose meter | Sinocare Inc. | GA-3 | |
Rapid tissue processor | Thermo Fisher Scientific Inc. | STP420 ES | |
Rat fixator | Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd | GEGD-Q10G1 | |
Slicing machine | Thermo Fisher Scientific Inc. | HM325 | |
Slides glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 80312-3181 | |
sodium citrate buffer | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | c1013 | |
Streptozotocin | Sigma | 57654595 |