Den streptozotocininduserte diabetiske sårmodellen hos mannlige SD-rotter er for tiden den mest brukte modellen for å studere sårheling i type I diabetes mellitus. Denne protokollen beskriver metodene som brukes til å konstruere denne modellen. Den presenterer og adresserer også potensielle utfordringer og undersøker progresjon og angiogene egenskaper av diabetiske sår.
En enkelt høy dose streptozotocininjeksjon etterfulgt av fulltykkelse hudeksisjon på dorsum av rotter er en vanlig metode for å konstruere dyremodeller av type 1 diabetiske sår. Feil manipulering kan imidlertid føre til modellustabilitet og høy dødelighet hos rotter. Dessverre er det få eksisterende retningslinjer for type 1 diabetisk sårmodellering, og de mangler detaljer og presenterer ikke spesifikke referansestrategier. Derfor beskriver denne protokollen den komplette prosedyren for å konstruere en type 1 diabetisk sårmodell og analyserer progresjonen og angiogene egenskaper til diabetiske sår. Type 1 diabetisk sårmodellering innebærer følgende trinn: fremstilling av streptozotocininjeksjon, induksjon av type 1 diabetes mellitus og konstruksjon av sårmodellen. Sårområdet ble målt dag 7 og dag 14 etter sår, og rottenes hudvev ble ekstrahert for histopatologisk og immunfluorescensanalyse. Resultatene viste at type 1 diabetes mellitus indusert av 55 mg / kg streptozotocin var assosiert med lavere dødelighet og høy suksessrate. Blodglukosenivået var relativt stabilt etter 5 ukers induksjon. Frekvensen av tilheling av diabetiske sår var signifikant lavere enn for normale sår på dag 7 og dag 14 (p < 0,05), men begge kunne nå mer enn 90 % på dag 14. Sammenliknet med normalgruppen var epidermal laglukning av diabetiske sår dag 14 ufullstendig og hadde forsinket reepitelialisering og signifikant lavere angiogenese (p < 0,01). Type 1 diabetisk sårmodell konstruert basert på denne protokollen har egenskapene til kronisk sårheling, inkludert dårlig lukking, forsinket reepitelisering og redusert angiogenese sammenlignet med normale rottesår.
Type 1 diabetes mellitus (T1DM) er en kronisk metabolsk sykdom preget av hyperglykemi og ødeleggelse av bukspyttkjertelen β-celler1. Et T1DM-sår er et kronisk ikke-helbredende sår og den vanligste og ødeleggende komplikasjonen av diabetes hos mennesker 2,3. Dyremodeller er de mest hensiktsmessige prototypene for å studere de patologiske endringene under sårheling og sikkerheten og effekten av potensielle terapeutiske midler4. Sammenlignet med andre typer er mannlige Sprague-Dawley (SD) rotter mer følsomme for streptozotocin (STZ) og viser en lavere relatert dødelighet, noe som gjør dem populære i diabetisk sårforskning 5,6.
Tallrike metoder for å konstruere T1DM sårmodeller har blitt beskrevet. Når det gjelder T1DM-modellen, har studier primært fokusert på effekten av STZ-injeksjonsmetoden på suksessraten for diabetesinduksjon 7,8. Modelleringsprosessen lider imidlertid av den inkonsekvente driften av det samme trinnet. I en studie fastet rotter i 18 timer før STZ-injeksjonen; rotter med blodsukkernivå høyere enn 16,67 mmol / l 1 uke etter STZ-injeksjonen ble ansett som diabetiker, og diabetisk sår ble introdusert etter 3 uker9. Omvendt, i en relatert studie, fastet Zhu et al. rotter i 12 timer før STZ-injeksjonen; rotter med høyere blodsukkernivå enn 16,7 mmol/l 72 timer etter injeksjonen ble ansett som diabetikere, og diabetikersåret ble introdusert etter 4 uker10. Samlet sett er det inkonsekvenser i STZ injeksjonsprotokoller, diabetesdiagnosekriterier og sårintroduksjonstider.
Når det gjelder sårmodellering, blir den fulle tykkelsen på rygghuden i de fleste studier skåret ut for å konstruere T1DM-sår etter vellykket diabetesinduksjon11,12,13. Selv om denne modellen er utsatt for hudkontraktur hos rotter, er den den mest brukte modellen i sårhelingsforskning fordi den er mindre arbeidsintensiv og er billig14,15. Likevel mangler metodestyrt forskning på denne eksisjonsteknikken i full tykkelse. Videre er det ingen enhetlige standarder i eksisterende studier angående sårstørrelse og lokalisasjon12,16. Sårets størrelse og plassering kan indirekte påvirke konsistensen av det eksperimentelle designet og den vitenskapelige gyldigheten av resultatene. Derfor er det et presserende behov for en standardprotokoll for T1DM-induksjon og sårmodellering som referanse for forskere. Målet med denne studien er å visualisere en spesifikk protokoll for T1DM sårmodellering som kan brukes som referanse for T1DM sårstudier.
Denne protokollen klargjør de omstridte operasjonene i T1DM sårmodellering. Bekymringer om STZ injeksjonsprotokoller, T1DM induksjon suksesskriterier, blodsukkerstabiliseringstid og sårplassering og størrelse har blitt adressert i dette arbeidet. Videre er patologiske egenskaper og målbare parametere for T1DM sårhelingsvurdering avklart.
Rottene fastet i 18 timer før STZ-injeksjonen for å unngå konkurransebinding av glukose eller dets analoger til β-celler, noe som kan påvirke effekten av STZ. Den mest brukte metoden for å indusere T1DM er en enkelt høy dose STZ, noe som øker blodsukkeret ved å skade øyene og redusere insulinutskillelsen21. Pre-eksperimentelle studier viste at den optimale STZ-dosen for høy suksessrate og lav dødelighet var 55 mg / kg, noe som er lavere enn de optimale dosene rapportert i tidligere studier22,23,24. I denne protokollen ble T1DM indusert ved bruk av en enkelt intraperitoneal injeksjon med 55 mg/kg STZ.
Blodsukkernivået var alle høyere enn 16,7 mmol / l 3 dager etter STZ-injeksjonen. Imidlertid er et blodsukkernivå høyere enn 16,7 mmol / l på dag 7 etter STZ-injeksjon det anbefalte kriteriet for vellykket T1DM-modellering, fordi omfanget av øyskader varierer blant rotter, og en passende forlengelse av diagnostisk tid kan redusere den falske negative frekvensen. I tillegg stabiliserte blodsukkerfluktuasjonene seg 5 uker etter STZ-injeksjonen, og rottene gikk gradvis opp i vekt i løpet av denne perioden, i samsvar med tidligere funn25,26. Dette indikerer at blodsukkernivået i T1DM-modellen bør stabiliseres i minst 6 uker, og en økning i rottevekt etter 6 uker reduserer dødeligheten under sårmodelleringen. Derfor gjennomførte denne protokollen sårmodellering 8 uker etter STZ-injeksjonen.
Sårlukkingsraten dag 7 og dag 14 etter såret var signifikant lavere hos diabetiker enn i den normale sårgruppen, noe som indikerer langsom tilheling. Videre var sårepitelialisering og angiogenese signifikant lavere hos diabetiker enn i normalgruppen. Dette viser at sårmodellen T1DM viser langsommere sårtilheling og forsinket reepitelisering enn hos normale rotter, noe som kan være relatert til de patologiske endringene ved redusert sårangiogenese. På dag 14 var imidlertid T1DM-sårhelingsraten også over 90 %, noe som er forskjellig fra den kroniske ikke-helbredende karakteristikken for humane diabetiske sår. Dette kan skyldes at gnagernes fysiologiske mekanismer for sårheling skiller seg fra menneskers27. Følgelig er den beste sårdiameteren minst 20 mm, noe som er stort nok til å gi tid til å vurdere en intervensjons effekt i en diabetisk sårstudie. Sårplasseringen bør unngå scapula og ryggrad, da kontinuerlig bevegelse på disse to stedene kan forstyrre sårheling.
Avslutningsvis er konstruksjonen av T1DM-sårmodellen ved hjelp av metoden til denne protokollen effektiv. Protokollen replikerer noen av egenskapene til kroniske diabetiske sår, for eksempel langsommere sårheling, forsinket reepitelisering og redusert angiogenese sammenlignet med normale rottesår. Det er imidlertid ukjent om modellen kan replikere andre kroniske fenotyper av diabetiske sår. Videre beskriver denne protokollen den mest grunnleggende og mest brukte metoden, som ikke tar hensyn til problemet med hudkontraksjon hos rotter. Fremtidig forskning kan inkludere bruk av sårskinner i denne protokollen eller utforske flere modeller av kroniske diabetessår, noe som vil være en betydelig utfordring for forskere i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet økonomisk av National Natural Science Foundation of China (82104877).
Antifade mounting medium | Southern Biotechnology Associates, Inc. | 0100-01 | |
AutoFluo Quencher | Servicebio Technology co., Ltd. | G1221 | |
Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific Inc. | Varistain™ Gemini ES | |
CD31 | Servicebio Technology co., Ltd. | GB11063-2 | |
Citrate antigen retrieval solution | Servicebio Technology co., Ltd. | G1201 | |
Cover glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 10212432C | |
DAPI | Servicebio Technology co., Ltd. | G1012 | |
Decolorization shaker | Scilogex | S1010E | |
Depilatory cream | Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd. | — | |
Dimethyl benzene | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 64-17-5 | |
Drug oscillator | Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. | VM-370 | |
Electric razor | Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. | FC5908 | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | |
Ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 1330-20-7 | |
Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG | Servicebio Technology co., Ltd. | GB22303 | |
Goat serum | Thermo Fisher Scientific Inc. | 16210064 | |
Hematoxylin and eosin staining solution | Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. | DH0020 | |
Image J software | National Institutes of Health | — | |
Microwave oven | Midea Group Co., Ltd. | M1-L213B | |
Mini centrifuge | Scilogex | D1008 | |
Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
Portable blood glucose meter | Sinocare Inc. | GA-3 | |
Rapid tissue processor | Thermo Fisher Scientific Inc. | STP420 ES | |
Rat fixator | Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd | GEGD-Q10G1 | |
Slicing machine | Thermo Fisher Scientific Inc. | HM325 | |
Slides glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 80312-3181 | |
sodium citrate buffer | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | c1013 | |
Streptozotocin | Sigma | 57654595 |