Her præsenterer vi en optimeret in vitro-metode til at afdække, kvantificere og validere proteininteraktorer af specifikke RNA-sekvenser ved hjælp af total proteinekstrakt fra humane celler, streptavidinperler belagt med biotinyleret RNA og massespektrometrianalyse.
Protein-RNA-interaktioner regulerer genekspression og cellulære funktioner på transkriptionelle og posttranskriptionelle niveauer. Af denne grund er identifikation af bindingspartnerne for et RNA af interesse fortsat af stor betydning for at afsløre mekanismerne bag mange cellulære processer. RNA-molekyler kan dog interagere forbigående og dynamisk med nogle RNA-bindende proteiner (RBP’er), især med ikke-kanoniske. Der er derfor et stort behov for forbedrede metoder til at isolere og identificere sådanne vandområdeprogrammer.
For at identificere proteinpartnerne i en kendt RNA-sekvens effektivt og kvantitativt udviklede vi en metode baseret på pull-down og karakterisering af alle interagerende proteiner, startende fra cellulært totalt proteinekstrakt. Vi optimerede proteinnedtrækningen ved hjælp af biotinyleret RNA, der var forudindlæst på streptavidin-coatede perler. Som et proof of concept anvendte vi en kort RNA-sekvens, der vides at binde det neurodegenerationsassocierede protein TDP-43 og en negativ kontrol af en anden nukleotidsammensætning, men af samme længde. Efter at have blokeret perlerne med gær-tRNA indlæste vi de biotinylerede RNA-sekvenser på streptavidinperlerne og inkuberede dem med det samlede proteinekstrakt fra HEK 293T-celler. Efter inkubation og flere vasketrin for at fjerne uspecifikke bindemidler eluerede vi de interagerende proteiner med en opløsning med højt saltindhold, kompatibel med de mest almindeligt anvendte proteinkvantificeringsreagenser og med prøveforberedelse til massespektrometri. Vi kvantificerede berigelsen af TDP-43 i pull-down udført med det kendte RNA-bindemiddel sammenlignet med den negative kontrol ved massespektrometri. Vi brugte den samme teknik til at verificere de selektive interaktioner mellem andre proteiner, der beregningsmæssigt forudsiges at være unikke bindemidler af vores RNA af interesse eller af kontrollen. Endelig validerede vi protokollen ved western blot via påvisning af TDP-43 med et passende antistof.
Denne protokol vil gøre det muligt at studere proteinpartnerne i et RNA af interesse i nær-til-fysiologiske tilstande, hvilket hjælper med at afdække unikke og uforudsigelige protein-RNA-interaktioner.
RNA-bindende proteiner (RBP’er) har vist sig som afgørende aktører i transkriptionel og posttranskriptionel genregulering, da de er involveret i processer som mRNA-splejsning, RNA-cellulær lokalisering, translation, modifikation og nedbrydning 1,2,3. Sådanne interaktioner mellem de to makromolekyler er stærkt koordinerede, præcist afbalancerede og afgørende for dannelsen af funktionelle og behandlingshubs. Variationer eller dysreguleringer inden for disse knudepunkter har potentialet til at forstyrre de fint regulerede protein-RNA-netværk og er i stigende grad forbundet med en række menneskelige sygdomme, herunder kræft 4,5 og neurodegenerative lidelser 6,7,8. Interaktionerne mellem RNA-molekyler og deres proteinbindende partnere kan enten være stabile og lette at validere eksperimentelt eller meget dynamiske, forbigående og vanskeligere at karakterisere.
I de senere år er der gjort en intensiv indsats for at forstå disse interaktioner. Blandt de mest etablerede metoder er protein pull-down assays (PD’er) sandsynligvis de mest værdsatte og almindeligt anvendte tilgange til at optrævle de vigtigste aktører, der udgør ribonukleoprotein (RNP) komplekser og andre protein-RNA interaktionsnetværk 3,9,10. PD’er omfatter en bred paraply af informative teknikker, såsom immunudfældning af enten RNA (RIP)11,12 eller proteinet (CLIP)13,14 af interesse. Nogle af disse RNA-PD-protokoller anvender et kendt RNA som lokkemad til proteiner15, oftest ved at drage fordel af mærker med høj affinitet, såsom biotin. I dette tilfælde kan interaktionspartnerne i et biotinyleret RNA detekteres ved at forankre RNA’et på streptavidinbelagte perler, hvilket muliggør effektiv isolering af RNP’erne. De vigtigste begrænsninger ved disse tilgange er normalt designet af de biotinylerede sonder og testningen af deres evne til at binde målproteiner. Til dette formål kan det være nyttigt at stole på offentliggjorte CLIP-data for proteinet af interesse, hvis de er tilgængelige, da de med høj præcision afslører de korte RNA-regioner, der svarer til toppe af interaktioner med målproteinet13,16. De samme regioner kunne bruges til at udvikle sonder til PD’er. En alternativ metode til at designe sådanne RNA-lokkemad kan være den systematiske udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX)17, som muliggør design af aptamerer gennem in vitro-selektion, startende fra et omfattende randomiseret bibliotek og via en række PCR-drevne optimeringscyklusser. SELEX er imidlertid kompleks og tidskrævende, og de endelige resultater er meget afhængige af det oprindelige bibliotek. For at vælge RNA-agn til brug i protokollen, der præsenteres her, blev endnu en tilgang udnyttet, der bestod i at bruge en RNA-agn designet de novo ved hjælp af beregningskraften i algoritmen catRAPID, som forudsiger præferencebindingen af et givet protein mod visse RNA-sekvenser18,19,20.
Protokollen, der introduceres her, er en version af en RNA-PD, der er optimeret til at eluere specifikke proteinpartnere under næsten fysiologiske forhold uden brug af vaskemiddel, denatureringsmidler eller høje temperaturer. Det er afhængig af nano-superparamagnetiske perler kovalent belagt med højt oprenset streptavidin og brugen af et specifikt in silico designet biotinyleret RNA som lokkemad. Denne protokol giver en hurtig og effektiv metode til at isolere bindingspartnerne af biotinylerede RNA-molekyler under native forhold, hvilket giver mulighed for en bred vifte af downstream-applikationer. For at teste denne protokol blev en 10-nukleotid enkeltstrenget RNA aptamersekvens, tidligere designet til at binde proteinet TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) med høj affinitet og specificitet, anvendt20. Med udgangspunkt i HEK 293T-cellelysater blev interaktorerne af den biotinylerede RNA-aptamer identificeret ved hjælp af massespektrometrianalyse udført på prøver løsrevet fra RNA-agn under anvendelse af en hypertonisk buffer. Denne analyse bekræftede den vellykkede identifikation og kvantificering af TDP-43 som foretrukket bindemiddel.
Denne protokol muliggør en vellykket identifikation af proteininteraktorer ved kun at anvende et kort, in vitro syntetiseret RNA-oligonukleotid. Desuden garanterer brugen af in silico-designede RNA-aptamerer som PD-sonder21,22 specificitet for målene til betydeligt reducerede omkostninger.
Dette arbejde rapporterer optimering af en PD-protokol udført med biotinylerede RNA-oligonukleotider for at fange deres proteininteraktorer. Den her beskrevne protokol er enkel at udføre, kræver lidt materiale og giver meget pålidelige resultater. Det er vigtigt, at de mest nye aspekter af denne protokol består af brugen af en RNA-agn designet fuldt ud i silico og specifik for proteinmålet og eluering af alle proteiner bundet til RNA-agn ved direkte at forstyrre deres interaktioner med en højsaltopløsning snarere end ved at adskille streptavidin fra biotinet med vaskemiddel og behandling ved høj temperatur.
Denne protokol udnytter styrken af bindingen mellem biotin og streptavidin29,30. Ifølge de valgte streptavidinperler skal belastningen af det biotinylerede RNA testes og kvantificeres, før det fortsættes. RNA tridimensionel foldning kan også påvirke belastningseffektiviteten på perlerne, da det kan begrænse eksponeringen af biotinet for streptavidin. Blokering af perlerne med ikke-biotinyleret tRNA forbedrer renheden af resultaterne ved at begrænse uspecifikke interaktioner med perlerne. Belastningsbufferen og elueringsbufferen skal vælges afhængigt af downstream-anvendelserne. Her blev der foreslået meget milde forhold, der var egnede til de fleste applikationer og udviklet til at bevare potentielle proteinkomplekser. Denne metode er dog meget tilpasningsdygtig; brugeren kan vælge en hvilken som helst cellelinje og enhver RNA-størrelse og kan beslutte at gentage protokollen efter foldning / udfoldning af RNA’et for at bestemme strukturens virkning på bindingsegenskaberne.
Et andet originalt aspekt af denne protokol er brugen af in silico-forudsigelsesværktøjer for at sikre, at resultaterne er korrekte20. At vide på forhånd, hvilke proteiner der skal identificeres som interaktorer af RNA af interesse, giver den hidtil usete fordel ved at validere de tekniske aspekter af protokollen. For eksempel er det ved hjælp af en simpel WB-analyse muligt at verificere tilstedeværelsen af et kendt proteinmål i prøverne afledt af de forskellige trin i protokollen, inden man fortsætter med MS-analysen, hvilket kræver specialiseret instrumentering og er dyrere. Derudover blev der for nylig rapporteret om en metode til at bruge catRAPID20, en intern protein-RNA-forudsigelsesalgoritme, til at designe de novo RNA, der er specifik for et målprotein. Indtil for nylig var den eneste tilgængelige pipeline til design af DNA/RNA-aptamerer til et målprotein SELEX-metoden (systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse)31. In silico-metoden muliggør et meget hurtigere og omkostningseffektivt design af RNA-aptamerer.
De vigtigste begrænsninger ved denne metode er forbundet med behovet for at arbejde i nukleasefrie buffere og værktøjer. Hvis det desuden anses for nødvendigt in vitro at bekræfte bindingen mellem et de novo-designet RNA og et målprotein forud for PD, skal proteinet produceres og oprenses, og bindingen bestemmes med biofysiske tilgange. Dette er en begrænsning, der deles med produktionen af monoklonale antistoffer.
På trods af disse mindre problemer kan pålidelige metoder til kortlægning af RNA-proteininteraktioner, som den, der præsenteres her, bringe forskere tættere på at afsløre makromolekylære netværk og komplekse hovedaktører i mange fysiologiske og patologiske mekanismer, såsom dem, der er involveret i kræft, kardiomyopatier, diabetes, mikrobielle infektioner og genetiske og neurodegenerative lidelser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke professor Tartaglias og Dr. Cuomos forskningsgruppe for den tilbudte støtte. E.Z. modtog finansiering fra MINDED-stipendiet fra EU’s Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 754490.
6-well tissue culture plates | VWR | 10861-554 | CELLS |
Cell scrapers | BIOSIGMA | 10153 | CELLS |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientfic | 11995065 | CELLS |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil | Thermo Fisher Scientfic | 10500064 | CELLS |
Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) | Thermo Fisher Scientfic | 14190169 | CELLS |
Trypsin (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientfic | 15050065 | CELLS |
Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) | Cellsignal | 7070 | PD |
Biotinylated RNA | Eurofins | Custom RNA oligonucleotides | PD |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | PD |
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Biorad | 1705061 | PD |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Merck – Sigma Aldrich | 5056489001 | PD |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | PD |
Recombinant anti-TDP43 antibody | Abcam | ab109535 | PD |
Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) | Merck – Sigma Aldrich | R5636-1ML | PD |
Streptavidin Mag Sepharose | Merck – Sigma Aldrich | GE28-9857-99 | PD |
Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit | Biorad | 1704272 | PD |
Acetone | Thermo Fisher Scientfic | 022928.K2 | MS |
C18 cartridge | Thermo Fisher Scientfic | 13-110-018 | MS |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientfic | 20290 | MS |
EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | ES902 | MS |
iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich S.r.l. | I6125 | MS |
Lys-C/Trypsin | Promega | V5073 | MS |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientfic | 28904 | MS |
Urea | Thermo Fisher Scientfic | J75826.A7 | MS |
Equipment | |||
ChemiDoc imaging system | Bio-Rad | CELLS | |
Dyna Mag -2 , Magnetic rack | Invitrogen | CELLS | |
Forma Series 3 water jacketed C02 incubator | Thermo Scientific | PD | |
PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications | Bio-Rad | PD | |
Rotating wheel, rotator SB3 | Stuart | PD | |
Water bath set at 37 °C | VWR | PD | |
XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system | ThermoFisher Scientific | MS | |
Easy-nLC 1200 UHPLC | Thermo Scientific | MS | |
Q exactive Mass Spectrometer | Thermo Scientific | MS | |
Software | Version | ||
MaxQuant | 2.0.3.0 | MS | |
Perseus | 1.6.14.0 | MS |