यहां, हम मानव कोशिकाओं से कुल प्रोटीन अर्क, बायोटिनीलेटेड आरएनए के साथ लेपित स्ट्रेप्टाविडिन मोती, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके विशिष्ट आरएनए अनुक्रमों के प्रोटीन इंटरएक्टर्स को उजागर करने, मात्रा निर्धारित करने और मान्य करने के लिए एक अनुकूलित इन विट्रो विधि प्रस्तुत करते हैं।
प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों पर जीन अभिव्यक्ति और सेलुलर कार्यों को नियंत्रित करते हैं। इस कारण से, कई सेलुलर प्रक्रियाओं के पीछे तंत्र का अनावरण करने के लिए रुचि के आरएनए के बाध्यकारी भागीदारों की पहचान करना उच्च महत्व का है। हालांकि, आरएनए अणु कुछ आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी) के साथ क्षणिक और गतिशील रूप से बातचीत कर सकते हैं, खासकर गैर-कैननिकल लोगों के साथ। इसलिए, ऐसे आरबीपी को अलग करने और पहचानने के लिए बेहतर तरीकों की बहुत आवश्यकता है।
एक ज्ञात आरएनए अनुक्रम के प्रोटीन भागीदारों को कुशलतापूर्वक और मात्रात्मक रूप से पहचानने के लिए, हमने सेलुलर कुल प्रोटीन निकालने से शुरू होने वाले सभी अंतःक्रियात्मक प्रोटीनों के पुल-डाउन और लक्षण वर्णन के आधार पर एक विधि विकसित की। हमने स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों पर प्री-लोडेड बायोटिनीलेटेड आरएनए का उपयोग करके प्रोटीन पुल-डाउन को अनुकूलित किया। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हमने एक छोटे आरएनए अनुक्रम को नियोजित किया जो न्यूरोडीजेनेरेशन से जुड़े प्रोटीन टीडीपी -43 और एक अलग न्यूक्लियोटाइड संरचना के नकारात्मक नियंत्रण को बांधने के लिए जाना जाता है लेकिन एक ही लंबाई। खमीर टीआरएनए के साथ मोतियों को अवरुद्ध करने के बाद, हमने स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों पर बायोटिनीलेटेड आरएनए अनुक्रमों को लोड किया और उन्हें एचईके 293 टी कोशिकाओं से कुल प्रोटीन अर्क के साथ इनक्यूबेट किया। निरर्थक बाइंडर्स को हटाने के लिए इनक्यूबेशन और कई धोने के चरणों के बाद, हमने एक उच्च-नमक समाधान के साथ बातचीत करने वाले प्रोटीन को शामिल किया, जो सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले प्रोटीन परिमाणीकरण अभिकर्मकों के साथ संगत है और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयार करता है। हमने मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में ज्ञात आरएनए बाइंडर के साथ किए गए पुल-डाउन में टीडीपी -43 के संवर्धन को निर्धारित किया। हमने अन्य प्रोटीनों की चयनात्मक बातचीत को सत्यापित करने के लिए एक ही तकनीक का उपयोग किया, जो कम्प्यूटेशनल रूप से हमारे आरएनए या नियंत्रण के अद्वितीय बाइंडर होने की भविष्यवाणी करते हैं। अंत में, हमने उचित एंटीबॉडी के साथ टीडीपी -43 का पता लगाने के माध्यम से वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा प्रोटोकॉल को मान्य किया।
यह प्रोटोकॉल निकट-से-शारीरिक स्थितियों में रुचि के आरएनए के प्रोटीन भागीदारों के अध्ययन की अनुमति देगा, जिससे अद्वितीय और अप्रत्याशित प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन को उजागर करने में मदद मिलेगी।
आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल जीन विनियमन में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में उभरे हैं, क्योंकि वे एमआरएनए स्प्लिसिंग, आरएनए सेलुलर स्थानीयकरण, अनुवाद, संशोधन और गिरावट 1,2,3 जैसी प्रक्रियाओं में शामिल हैं। दो मैक्रोमोलेक्यूल्स के बीच इस तरह की बातचीत अत्यधिक समन्वित, सटीक रूप से संतुलित और कार्यात्मक और प्रसंस्करण केंद्रों के गठन के लिए आवश्यक है। इन केंद्रों के भीतर भिन्नताओं या डिसरेगुलेशन में बारीक विनियमित प्रोटीन-आरएनए नेटवर्क को बाधित करने की क्षमता होती है और कैंसर 4,5 और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार 6,7,8 सहित विभिन्न प्रकार के मानव रोगों से तेजी से जुड़े होते हैं। आरएनए अणुओं और उनके प्रोटीन बाइंडिंग भागीदारों के बीच बातचीत या तो स्थिर और प्रयोगात्मक रूप से मान्य करने में आसान हो सकती है, या अत्यधिक गतिशील, क्षणिक और चिह्नित करने के लिए अधिक कठिन हो सकती है।
हाल के वर्षों में, इन इंटरैक्शन को समझने के लिए गहन प्रयास किए गए हैं। सबसे स्थापित तरीकों में, प्रोटीन पुल-डाउन परख (पीडी) संभवतः राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) कॉम्प्लेक्स और अन्य प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन नेटवर्क 3,9,10 का गठन करने वाले मुख्य खिलाड़ियों को उजागर करने के लिए सबसे अधिक सराहना और आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण हैं। पीडी में सूचनात्मक तकनीकों की एक व्यापक छतरी शामिल है, जैसे कि आरएनए (आरआईपी) 11,12 या प्रोटीन (सीएलआईपी) 13,14 की प्रतिरक्षा। इनमें से कुछ आरएनए-पीडी प्रोटोकॉल प्रोटीन15 के लिए चारा के रूप में एक ज्ञात आरएनए को नियोजित करते हैं, अक्सर बायोटिन जैसे उच्च आत्मीयता टैग का लाभ उठाकर। इस उदाहरण में, स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों पर आरएनए को लंगर डालकर बायोटिनीलेटेड आरएनए के इंटरैक्शन पार्टनर्स का पता लगाया जा सकता है, जिससे आरएनपी के कुशल अलगाव को सक्षम किया जा सकता है। इन दृष्टिकोणों की मुख्य सीमाएं आमतौर पर बायोटिनीलेटेड जांच का डिजाइन और लक्ष्य प्रोटीन को बांधने की उनकी क्षमता का परीक्षण हैं। इस उद्देश्य के लिए, यदि उपलब्ध हो, तो रुचि के प्रोटीन के प्रकाशित सीएलआईपी डेटा पर भरोसा करना उपयोगी हो सकता है, क्योंकि वे उच्च परिशुद्धता के साथ, छोटे आरएनए क्षेत्रों को प्रकट करते हैं जो लक्ष्य प्रोटीन13,16 के साथ बातचीत की चोटियों के अनुरूप हैं। इन क्षेत्रों का उपयोग पीडी के लिए जांच विकसित करने के लिए किया जा सकता है। इस तरह के आरएनए चारा को डिजाइन करने का एक वैकल्पिक तरीका घातीय संवर्धन (एसईएलईएक्स) 17 द्वारा लिगेंड का व्यवस्थित विकास हो सकता है, जो इन विट्रो चयन के माध्यम से एपटामर के डिजाइन को सक्षम करता है, जो एक व्यापक यादृच्छिक पुस्तकालय से शुरू होता है और पीसीआर-संचालित अनुकूलन चक्रों की एक श्रृंखला के माध्यम से होता है। हालांकि, एसईएलईएक्स जटिल और समय लेने वाला है, और अंतिम परिणाम प्रारंभिक पुस्तकालय पर अत्यधिक निर्भर हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में उपयोग करने के लिए आरएनए चारा का चयन करने के लिए, एक और दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था, जिसमें एल्गोरिदम कैटरैपिड की कम्प्यूटेशनल शक्ति के माध्यम से नए सिरे से डिजाइन किए गए आरएनए चारा का उपयोग करना शामिल था, जो कुछ आरएनए अनुक्रमों 18,19,20 के प्रति किसी दिए गए प्रोटीन के अधिमान्य बंधन की भविष्यवाणी करता है।
यहां पेश किया गया प्रोटोकॉल एक आरएनए-पीडी का एक संस्करण है जो डिटर्जेंट, विकृत एजेंटों या उच्च तापमान के उपयोग के बिना, निकट-से-शारीरिक स्थितियों में विशिष्ट प्रोटीन भागीदारों को अनुकूलित करने के लिए अनुकूलित है। यह अत्यधिक शुद्ध स्ट्रेप्टाविडिन के साथ सहसंयोजक रूप से लेपित नैनो-सुपरपैरामैग्नेटिक मोतियों पर निर्भर करता है और एक चारा के रूप में सिलिको डिज़ाइन किए गए बायोटिनीलेटेड आरएनए में एक विशिष्ट का उपयोग करता है। यह प्रोटोकॉल मूल परिस्थितियों में बायोटिनीलेटेड आरएनए अणुओं के बाध्यकारी भागीदारों को अलग करने के लिए एक तेज़ और कुशल विधि प्रदान करता है, जो डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला की क्षमता प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए, एक 10-न्यूक्लियोटाइड एकल फंसे हुए आरएनए एपटामर अनुक्रम, जिसे पहले प्रोटीन टीएआर डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन 43 (टीडीपी -43) को उच्च आत्मीयता और विशिष्टता के साथ बांधने के लिए डिज़ाइन किया गया था,का उपयोग किया गया था। एचईके 293 टी सेल लाइसेट से शुरू होकर, बायोटिनीलेटेड आरएनए एपटामर के इंटरएक्टर्स की पहचान हाइपरटोनिक बफर का उपयोग करके आरएनए चारा से अलग किए गए नमूनों पर किए गए मास-स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से की गई थी। इस विश्लेषण ने पसंदीदा बाइंडर के रूप में टीडीपी -43 की सफल पहचान और परिमाणीकरण की पुष्टि की।
यह प्रोटोकॉल केवल एक छोटे, इन विट्रो संश्लेषित आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का उपयोग करके प्रोटीन इंटरएक्टर्स की सफल पहचान को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, पीडी जांच21,22 के रूप में सिलिको डिज़ाइन किए गए आरएनए एपटामर का उपयोग काफी कम लागत पर लक्ष्यों के लिए विशिष्टता की गारंटी देता है।
यह काम उनके प्रोटीन इंटरएक्टर्स को पकड़ने के लिए बायोटिनीलेटेड आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ किए गए पीडी प्रोटोकॉल के अनुकूलन की रिपोर्ट करता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए सरल है, कम सामग्री की आवश्यकता होती है, और अत्यधिक विश्वसनीय परिणाम उत्पन्न करता है। महत्वपूर्ण रूप से, इस प्रोटोकॉल के सबसे नवीन पहलुओं में सिलिको में पूरी तरह से डिज़ाइन किए गए और प्रोटीन लक्ष्य के लिए विशिष्ट आरएनए चारा का उपयोग शामिल है, और डिटर्जेंट और उच्च तापमान उपचार के साथ बायोटिन से स्ट्रेप्टाविडिन को अलग करने के बजाय, उच्च नमक समाधान के साथ उनकी बातचीत को सीधे बाधित करके आरएनए चारा से बंधे सभी प्रोटीनों का क्षालन शामिल है।
यह प्रोटोकॉल बायोटिन और स्ट्रेप्टाविडिन29,30 के बीच बंधन की ताकत का लाभ उठाता है। चुने हुए स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के अनुसार, आगे बढ़ने से पहले बायोटिनीलेटेड आरएनए की लोडिंग का परीक्षण और मात्रा निर्धारित की जानी चाहिए। इसके अलावा, आरएनए त्रि-आयामी तह मोतियों पर लोडिंग दक्षता को प्रभावित कर सकती है, क्योंकि यह स्ट्रेप्टाविडिन के लिए बायोटिन के जोखिम को सीमित कर सकती है। गैर-बायोटिनीलेटेड टीआरएनए के साथ मोतियों को अवरुद्ध करने से मोतियों के साथ निरर्थक बातचीत को सीमित करके परिणामों की स्वच्छता में सुधार होता है। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के आधार पर लोडिंग बफर और क्षालन बफर को चुना जाना चाहिए। यहां, बहुत हल्की स्थितियां, अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त और संभावित प्रोटीन परिसरों को संरक्षित करने के लिए विकसित, प्रस्तावित की गई थीं। हालांकि यह विधि अत्यधिक अनुकूलनीय है; उपयोगकर्ता किसी भी सेल लाइन और किसी भी आरएनए आकार का चयन कर सकता है, और बाध्यकारी गुणों पर संरचना के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए आरएनए के फोल्ड / प्रकट होने के बाद प्रोटोकॉल को दोहराने का निर्णय ले सकता है।
इस प्रोटोकॉल का एक अन्य मूलपहलू परिणामों की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए सिलिको भविष्यवाणी उपकरणों में उपयोग है। पहले से जानना कि किन प्रोटीनों को रुचि के आरएनए के इंटरएक्टर्स के रूप में पहचाना जाना चाहिए, प्रोटोकॉल के तकनीकी पहलुओं को मान्य करने का अभूतपूर्व लाभ देता है। उदाहरण के लिए, एक साधारण डब्ल्यूबी विश्लेषण का उपयोग करके, एमएस विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों से प्राप्त नमूनों में एक ज्ञात प्रोटीन लक्ष्य की उपस्थिति को सत्यापित करना संभव है, जिसके लिए विशेष उपकरण की आवश्यकता होती है और यह अधिक महंगा है। इसके अलावा, एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट नए आरएनए को डिजाइन करने के लिए कैटरैपिड20, एक इन-हाउस प्रोटीन-आरएनए भविष्यवाणी एल्गोरिदम का उपयोग करने की एक विधि हाल ही में रिपोर्ट की गई थी। कुछ समय पहले तक, एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए डीएनए / आरएनए एपटामर डिजाइन करने के लिए एकमात्र उपलब्ध पाइपलाइन एसईएलईएक्स (घातीय संवर्धन द्वारा लिगेंड का व्यवस्थित विकास) दृष्टिकोण31 था। इन सिलिको विधि आरएनए एपटामर के बहुत तेज और लागत प्रभावी डिजाइन के लिए सक्षम बनाती है।
इस पद्धति की मुख्य सीमाएं न्यूक्लियस-मुक्त बफर और उपकरणों में काम करने की आवश्यकता से जुड़ी हैं। इसके अलावा, यदि इन विट्रो में एक डे नोवो-डिज़ाइन किए गए आरएनए और एक लक्ष्य प्रोटीन पूर्व पीडी के बीच बंधन की पुष्टि करना आवश्यक माना जाता है, तो प्रोटीन का उत्पादन और शुद्ध करने और बायोफिज़िकल दृष्टिकोण के साथ बंधन निर्धारित करने की आवश्यकता होती है। यह एक सीमा है जो मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उत्पादन के साथ साझा की जाती है।
इन मामूली मुद्दों के बावजूद, आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन को मैप करने के विश्वसनीय तरीके, जैसे कि यहां प्रस्तुत किया गया है, वैज्ञानिकों को मैक्रोमोलेक्यूलर नेटवर्क और कई शारीरिक और रोग तंत्र के जटिल मुख्य अभिनेताओं का अनावरण करने के करीब ला सकता है, जैसे कि कैंसर, कार्डियोमायोपैथी, मधुमेह, माइक्रोबियल संक्रमण और आनुवंशिक और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में शामिल।
The authors have nothing to disclose.
लेखक प्रोफेसर टार्टाग्लिया और डॉ कुओमो के शोध समूह को समर्थन की पेशकश के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। ईजेड को मैरी स्क्लोडोव्स्का-क्यूरी अनुदान समझौते संख्या 754490 के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम के माइंडेड फैलोशिप से धन प्राप्त हुआ।
6-well tissue culture plates | VWR | 10861-554 | CELLS |
Cell scrapers | BIOSIGMA | 10153 | CELLS |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientfic | 11995065 | CELLS |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil | Thermo Fisher Scientfic | 10500064 | CELLS |
Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) | Thermo Fisher Scientfic | 14190169 | CELLS |
Trypsin (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientfic | 15050065 | CELLS |
Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) | Cellsignal | 7070 | PD |
Biotinylated RNA | Eurofins | Custom RNA oligonucleotides | PD |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | PD |
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Biorad | 1705061 | PD |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Merck – Sigma Aldrich | 5056489001 | PD |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | PD |
Recombinant anti-TDP43 antibody | Abcam | ab109535 | PD |
Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) | Merck – Sigma Aldrich | R5636-1ML | PD |
Streptavidin Mag Sepharose | Merck – Sigma Aldrich | GE28-9857-99 | PD |
Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit | Biorad | 1704272 | PD |
Acetone | Thermo Fisher Scientfic | 022928.K2 | MS |
C18 cartridge | Thermo Fisher Scientfic | 13-110-018 | MS |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientfic | 20290 | MS |
EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | ES902 | MS |
iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich S.r.l. | I6125 | MS |
Lys-C/Trypsin | Promega | V5073 | MS |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientfic | 28904 | MS |
Urea | Thermo Fisher Scientfic | J75826.A7 | MS |
Equipment | |||
ChemiDoc imaging system | Bio-Rad | CELLS | |
Dyna Mag -2 , Magnetic rack | Invitrogen | CELLS | |
Forma Series 3 water jacketed C02 incubator | Thermo Scientific | PD | |
PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications | Bio-Rad | PD | |
Rotating wheel, rotator SB3 | Stuart | PD | |
Water bath set at 37 °C | VWR | PD | |
XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system | ThermoFisher Scientific | MS | |
Easy-nLC 1200 UHPLC | Thermo Scientific | MS | |
Q exactive Mass Spectrometer | Thermo Scientific | MS | |
Software | Version | ||
MaxQuant | 2.0.3.0 | MS | |
Perseus | 1.6.14.0 | MS |