Aqui, descrevemos a metodologia usada para gerar cepas de L. panamensis e L . donovani expressando o gene para eGFP como um transgene integrado estável usando o sistema pLEXSY. Os parasitas transfectados foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência em ambas as espécies foram selecionados para uso posterior em ensaios de triagem de drogas.
Protozoários parasitas do gênero Leishmania causam leishmaniose , doença com manifestações clínicas variáveis que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. A infecção por L. donovani pode resultar em doença visceral fatal. No Panamá, Colômbia e Costa Rica, L. panamensis é responsável pela maioria dos casos relatados de leishmaniose cutânea e mucocutânea. Estudar um grande número de candidatos a fármacos com as metodologias disponíveis até o momento é bastante difícil, uma vez que são muito trabalhosos para avaliar a atividade de compostos contra formas intracelulares do parasita ou para realizar ensaios in vivo . Neste trabalho, descrevemos a geração de cepas de L. panamensis e L. donovani com expressão constitutiva do gene que codifica para uma proteína fluorescente verde reforçada (eGFP) integrada ao locus que codifica para o 18S rRNA (ssu). O gene que codifica a eGFP foi obtido a partir de um vetor comercial e amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) para enriquecê-lo e adicionar sítios de restrição para as enzimas BglII e KpnI. O amplicon da eGFP foi isolado por purificação em gel de agarose, digerido com as enzimas BglII e KpnI e ligado ao vetor de expressão de Leishmania pLEXSY-sat2.1 previamente digerido com o mesmo conjunto de enzimas. O vetor de expressão com o gene clonado foi propagado em E. coli, purificado, e a presença da inserção foi verificada por PCR de colônia. O plasmídeo purificado foi linearizado e utilizado para transfectar os parasitas L. donovani e L . panamensis. A integração do gene foi verificada por PCR. A expressão do gene eGFP foi avaliada por citometria de fluxo. Os parasitas fluorescentes foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência foram selecionados por citometria de fluxo.
Protozoários parasitas do gênero Leishmania causam leishmaniose, uma doença com uma ampla gama de manifestações clínicas. Essa doença é prevalente em 98 países, e sua incidência anual é estimada em 0,9 a 1,6 milhão decasos1. As espécies de Leishmania patogênicas para o homem são divididas em dois subgêneros, a saber, L. (Leishmania) e L. (Viannia). Infecção por algumas espécies pertencentes à L. Subgêneros (Leishmania), como L. donovani e L. infantum, podem resultar em leishmaniose visceral (LV), que é fatal se não tratada2. Espécies pertencentes ao L. Os subgêneros (Viannia) estão associados à maioria dos casos de leishmaniose cutânea (LC) e leishmaniose tegumentar americana (LCM) nas Américas Central e do Sul, particularmente no Panamá, Colômbia e Costa Rica, sendo a L. panamensis o principal agente etiológico dessas apresentações clínicas 3,4.
A quimioterapia anti-leishmania existente que inclui drogas como antimoniais pentavalentes, miltefosina e anfotericina B é altamente tóxica e cara. Além disso, o aumento da resistência aos fármacos nas últimas décadas tem se somado aos fatores que interferem no tratamento efetivo dos pacientes em todo omundo5. Diferenças substanciais têm sido demonstradas entre as espécies do gênero Leishmania em relação à suscetibilidade a drogas, especialmente entre espécies do Novo e do Velho Mundo 6,7. Por essas razões, é necessário direcionar esforços para a identificação e desenvolvimento de novas drogas anti-leishmania, com especial atenção às abordagens espécie-específicas. Estudar grandes bibliotecas de candidatos a fármacos com metodologias tradicionais é bastante difícil, uma vez que essas metodologias são muito trabalhosas para avaliar a atividade de compostos contra amastigotas intracelulares ou para realizar experimentos in vivo8; Portanto, tem sido necessário o desenvolvimento de novas técnicas que reduzam essas desvantagens, incluindo a implementação de genes repórteres e o desenvolvimento de ensaios de triagem fenotípica de alto conteúdo9.
O uso de genes repórteres mostrou o potencial de aumentar a eficiência do processo de triagem de drogas, pois facilita o desenvolvimento de ensaios de alto rendimento e in vivo. Parasitas recombinantes de Leishmania expressando vários genes repórteres têm sido gerados por vários grupos de pesquisa. Genes repórteres, como β-galactosidase, β-lactamase e luciferase, têm sido introduzidos em várias espécies de Leishmania utilizando vetores epissomais, mostrando utilidade limitada para triagem de drogas nas formas extra- e intracelulares do parasita10,11,12,13,14,15. Essas abordagens têm a limitação de exigir uma forte pressão seletiva em cultura para evitar a eliminação do construto epissomal, bem como o uso de reagentes adicionais para revelar a atividade do gene repórter. Por outro lado, a proteína fluorescente verde (GFP) e sua variante, a proteína fluorescente verde reforçada (eGFP), têm sido utilizadas na geração de um grande número de cepas transgênicas de Leishmania para ensaios de triagem in vitro de fármacos devido à sua flexibilidade e sensibilidade, bem como à possibilidade de automatizar o processo de triagem por citometria de fluxo ou fluorometria15, 16,17,18,19. Apesar dos resultados promissores, as culturas dessas cepas transgênicas foram altamente heterogêneas em seus níveis de fluorescência, uma vez que o número de cópias do gene GFP não foi o mesmo em todos os parasitas. Além disso, a manutenção da fluorescência exigiu pressão seletiva constante sobre os parasitas em cultura, uma vez que o gene GFP foi introduzido em uma construção epissomal.
Pelas razões expostas anteriormente, muitos esforços têm se concentrado no desenvolvimento de novas metodologias para a produção de cepas recombinantes estáveis. Esses esforços têm se baseado principalmente na integração de genes repórteres em locos ribossomais, aproveitando as maiores taxas de transcrição de genes ribossomais20. Cepas de L. infantum e L. amazonensis foram geradas integrando os genes que codificam para β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP22 e tdTomato23, e foram avaliadas quanto à sua utilidade em ensaios de triagem de fármacos. Vários grupos desenvolveram cepas de L. donovani que expressam a GFP constitutivamente, integrando seu gene codificador ao locus do RNA ribossomal 18S (locus ssu) através de recombinação homóloga24,25; apresentaram expressão estável e homogênea de GFP na população transfectada, incluindo amastigotas intracelulares 24,25, e foram implementadas com sucesso em ensaios de triagem de drogas24,25,26. Bolhassani et al.27 desenvolveram cepas de L. major e L. infantum expressando GFP como um transgene integrado. Eles utilizaram o vetor de integração pLEXSY, originalmente projetado para a expressão transgênica de proteínas em um sistema usando L. tarentolae como hospedeiro28. O vetor pLEXSY-GFP tem se mostrado muito eficiente para a geração de diferentes cepas de Leishmania expressando constitutivamente GFP 24,25,27,29,30. Nesses parasitas, a fluorescência é homogênea e mantida nas formas intracelulares, podendo ser detectada em lesões de coxins plantares de camundongosinfectados27.
Neste trabalho, descrevemos a metodologia utilizada para gerar cepas de L. panamensis e L . donovani expressando o gene que codifica para eGFP como um transgene integrado usando o sistema pLEXSY. As cepas geradas por esse processo são utilizadas em nosso laboratório para a realização de ensaios de triagem de fármacos que avaliam a potencial atividade anti-leishmania de moléculas de origem natural e sintética.
As vantagens e desvantagens de vários genes repórteres têm sido estudadas em vários protozoários parasitas. Dentre elas, a GFP e a eGFP são intrinsecamente fluorescentes e permitem fácil quantificação e obtenção de imagens. A atividade fluorescente dessas proteínas pode ser detectada com manipulação mínima usando microscopia de fluorescência, fluorimetria ou citometria de fluxo. Poucos estudos foram realizados para gerar L expressando GFP. (Viannia), apesar da robustez demonstrada da GFP…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela Secretaria Nacional de Ciência, Tecnologia e Innovación (SENACYT), Panamá, processo número NI-177-2016, e Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, números de processo SNI-169-2018, SNI-008-2022 e SNI-060-2022.
96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem |
PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |