تطوير سلالات أنواع الليشمانيا مع التعبير التأسيسي ل eGFP
Summary
هنا ، نصف المنهجية المستخدمة لتوليد سلالات L. panamensis و L . donovani التي تعبر عن جين eGFP كجين تحوير متكامل مستقر باستخدام نظام pLEXSY. تم استنساخ الطفيليات المنقولة عن طريق الحد من التخفيف ، وتم اختيار الحيوانات المستنسخة ذات أعلى كثافة مضان في كلا النوعين لاستخدامها مرة أخرى في فحوصات فحص الأدوية.
Abstract
تسبب الطفيليات الأولية من جنس الليشمانيا داء الليشمانيات ، وهو مرض له مظاهر سريرية متغيرة يصيب ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم. يمكن أن تؤدي العدوى ب L. donovani إلى مرض حشوي مميت. في بنما وكولومبيا وكوستاريكا ، L. panamensis هو المسؤول عن معظم الحالات المبلغ عنها من داء الليشمانيات الجلدي والمخاطي. إن دراسة عدد كبير من الأدوية المرشحة بالمنهجيات المتاحة حتى الآن أمر صعب للغاية ، نظرا لأنها شاقة للغاية لتقييم نشاط المركبات ضد الأشكال داخل الخلايا للطفيلي أو لأداء المقايسات في الجسم الحي . في هذا العمل ، نصف جيل سلالات L. panamensis و L. donovani مع التعبير التأسيسي للجين الذي يشفر لبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (eGFP) المدمج في الموضع الذي يشفر ل 18S rRNA (ssu). تم الحصول على eGFP المشفر الجيني من ناقل تجاري وتم تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لإثرائه وإضافة مواقع تقييد لإنزيمات BglII و KpnI. تم عزل أمبليكون eGFP عن طريق تنقية هلام الأغاروز ، وهضمه مع الإنزيمات BglII و KpnI ، وربطه في ناقل تعبير الليشمانيا pLEXSY-sat2.1 الذي تم هضمه مسبقا بنفس مجموعة الإنزيمات. تم نشر ناقل التعبير مع الجين المستنسخ في الإشريكية القولونية ، وتنقيته ، وتم التحقق من وجود الإدراج بواسطة مستعمرة PCR. تم تحويل البلازميد المنقى خطيا واستخدامه لنقل طفيليات L. donovani و L . panamensis. تم التحقق من تكامل الجين بواسطة PCR. تم تقييم التعبير عن جين eGFP عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم استنساخ الطفيليات الفلورية عن طريق الحد من التخفيف ، وتم اختيار الحيوانات المستنسخة ذات أعلى كثافة مضان باستخدام قياس التدفق الخلوي.
Introduction
الطفيليات الأولية من جنس الليشمانيا تسبب داء الليشمانيات ، وهو مرض له مجموعة واسعة من المظاهر السريرية. ينتشر هذا المرض في 98 دولة ، ويقدر معدل حدوثه السنوي ب 0.9 إلى 1.6 مليون حالة1. تنقسم أنواع الليشمانيا المسببة للأمراض للإنسان إلى جنسين فرعيين ، وهما L. (الليشمانيا) ول. (فيانيا). العدوى مع بعض الأنواع التي تنتمي إلى L. (الليشمانيا) قد يؤدي الجنس الفرعي ، مثل L. donovani و L. infantum ، إلى داء الليشمانيات الحشوي (VL) ، وهو قاتل إذا ترك دون علاج2. الأنواع التي تنتمي إلى L. يرتبط الجنس الفرعي (Viannia) بمعظم حالات داء الليشمانيات الجلدي (CL) وداء الليشمانيات المخاطي الجلدي (MCL) في أمريكا الوسطى والجنوبية ، وخاصة في بنما وكولومبيا وكوستاريكا ، مع كون L. panamensis العامل المسبب الرئيسي لهذه العروض السريرية 3,4.
العلاج الكيميائي الحالي المضاد لليشمانيا الذي يتضمن أدوية مثل الأنتيمون خماسي التكافؤ وميلتيفوسين والأمفوتريسين ب شديد السمية ومكلف. وعلاوة على ذلك، أضيفت زيادة مقاومة الأدوية خلال العقود الأخيرة إلى العوامل التي تتداخل مع العلاج الفعال للمرضى في جميع أنحاء العالم5. تم إثبات اختلافات جوهرية عبر أنواع جنس الليشمانيا فيما يتعلق بالحساسية للأدوية ، خاصة بين أنواع العالم الجديدوالقديم 6,7. لهذه الأسباب ، من الضروري توجيه الجهود لتحديد وتطوير عقاقير جديدة لمكافحة الليشمانيا ، مع إيلاء اهتمام خاص للنهج الخاصة بالأنواع. من الصعب للغاية دراسة المكتبات الكبيرة للأدوية المرشحة ذات المنهجيات التقليدية ، نظرا لأن هذه المنهجيات شاقة للغاية لتقييم نشاط المركبات ضد الأماستيجوتات داخل الخلايا أو لإجراء تجارب في الجسم الحي 8 ؛ لذلك ، كان من الضروري تطوير تقنيات جديدة تقلل من هذه العيوب ، بما في ذلك تنفيذ جينات المراسل وتطوير فحوصات فحص النمط الظاهري عالية المحتوى9.
أظهر استخدام جينات المراسل إمكانية زيادة كفاءة عملية فحص الأدوية لأنها تسهل تطوير فحوصات عالية الإنتاجية وفي الجسم الحي. تم إنشاء طفيليات الليشمانيا المؤتلفة التي تعبر عن العديد من جينات المراسل من قبل مجموعات بحثية مختلفة. تم إدخال جينات المراسل ، مثل β-galactosidase و β-lactamase و luciferase ، في العديد من أنواع الليشمانيا باستخدام النواقل العرضية ، مما يدل على فائدة محدودة لفحص الأدوية في أشكال خارج الخلايا وداخلها من الطفيلي 10،11،12،13،14،15. هذه الأساليب لها حدود تتطلب ضغطا انتقائيا قويا في الثقافة لتجنب القضاء على البنية العرضية ، وكذلك استخدام كواشف إضافية للكشف عن نشاط جين المراسل. على العكس من ذلك ، تم استخدام بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ومتغيره ، بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (eGFP) ، في توليد عدد كبير من سلالات الليشمانيا المعدلة وراثيا لفحوصات فحص الأدوية في المختبر بسبب مرونتها وحساسيتها ، وكذلك إمكانية أتمتة عملية الفحص باستخدام قياس التدفق الخلوي أو القياس الفلوري15 ، 16,17,18,19. على الرغم من النتائج الواعدة ، كانت مزارع هذه السلالات المعدلة وراثيا غير متجانسة للغاية في مستويات مضانها ، لأن عدد نسخ جين GFP لم يكن هو نفسه في جميع الطفيليات. علاوة على ذلك ، يتطلب الحفاظ على التألق ضغطا انتقائيا ثابتا على الطفيليات في الثقافة ، حيث تم إدخال جين GFP في بنية عرضية.
للأسباب المذكورة من قبل ، ركزت العديد من الجهود على تطوير منهجيات جديدة لإنتاج سلالات مستقرة مؤتلفة. اعتمدت هذه الجهود في الغالب على دمج جينات المراسل في المواقع الريبوسومية ، مستفيدة من معدلات النسخ الأعلى للجينات الريبوسومية20. تم إنشاء سلالات من L. infantum و L. amazonensis بعد دمج الجينات المشفرة ل β-galactocidase 21 و IFP 1.4 و iRFP22 و tdTomato23 ، وتم تقييمها لفائدتها في فحوصات فحص الأدوية. طورت مجموعات مختلفة سلالات L. donovani التي تعبر عن GFP بشكل أساسي من خلال دمج جينها المشفر في موضع الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 18S (ssu locus) من خلال إعادة التركيب المتماثل24,25 ؛ أظهروا تعبيرا مستقرا ومتجانسا عن GFP في السكان المنقولين ، بما في ذلك amastigotes داخل الخلايا 24,25 ، وتم تنفيذها بنجاح في فحوصات فحص المخدرات24,25,26. طور Bolhassani et al.27 سلالات من L. major و L. infantum تعبر عن GFP كجين تحوير متكامل. استخدموا ناقل التكامل pLEXSY ، المصمم أصلا للتعبير الوراثي للبروتينات في نظام يستخدم L. tarentolae كمضيف28. أظهر ناقل pLEXSY-GFP أنه فعال للغاية لتوليد سلالات مختلفة من الليشمانيا تعبر بشكل أساسي عن GFP24،25،27،29،30. في هذه الطفيليات ، يكون التألق متجانسا ويتم الحفاظ عليه في الأشكال داخل الخلايا ، حيث يمكن اكتشافه في آفات وسادة القدم للفئران المصابة27.
في هذا العمل ، نصف المنهجية المستخدمة لتوليد سلالات L. panamensis و L . donovani التي تعبر عن تشفير الجينات ل eGFP كجين تحوير متكامل باستخدام نظام pLEXSY. تستخدم السلالات الناتجة عن هذه العملية في مختبرنا لإجراء فحوصات فحص الأدوية التي تقيم النشاط المحتمل لمكافحة الليشمانيا للجزيئات ذات الأصل الطبيعي والاصطناعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمت دراسة مزايا وعيوب جينات المراسل المختلفة في العديد من الطفيليات الأولية. من بينها ، GFP و eGFP هي في جوهرها الفلورسنت وتسمح بسهولة القياس الكمي والتصوير. يمكن الكشف عن النشاط الفلوري لهذه البروتينات بأقل قدر من التلاعب باستخدام الفحص المجهري الفلوري أو القياس الفلوري أو قياس التدفق الخل?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل الأمانة الوطنية للعلوم والتكنولوجيا والابتكار (SENACYT) ، بنما ، رقم المنحة NI-177-2016 ، والنظام الوطني للبحوث (SNI) ، بنما ، أرقام المنح SNI-169-2018 و SNI-008-2022 و SNI-060-2022.
Materials
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
Referências
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).
- Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243 (2020).
- Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
- Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266 (2016).
- Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
- Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
- Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
- Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
- Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
- Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
- Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
- Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
- Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
- Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).
- García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).
- Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
- De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771 (2015).
- Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
- Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
- Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
- Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
- Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , (2012).
- Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
- Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
- Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).
- Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
- Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).
