Développement de souches d’espèces de Leishmania avec expression constitutive de eGFP
Summary
Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée pour générer des souches de L. panamensis et de L. donovani exprimant le gène de l’eGFP en tant que transgène intégré stable à l’aide du système pLEXSY. Les parasites transfectés ont été clonés par dilution limite, et les clones ayant l’intensité de fluorescence la plus élevée chez les deux espèces ont été sélectionnés pour une utilisation ultérieure dans les tests de dépistage de médicaments.
Abstract
Les parasites protozoaires du genre Leishmania provoquent la leishmaniose , une maladie aux manifestations cliniques variables qui touche des millions de personnes dans le monde. L’infection par L. donovani peut entraîner une maladie viscérale mortelle. Au Panama, en Colombie et au Costa Rica, L. panamensis est responsable de la plupart des cas signalés de leishmaniose cutanée et cutanéo-muqueuse. L’étude d’un grand nombre de candidats médicaments avec les méthodologies disponibles à ce jour est assez difficile, étant donné qu’elles sont très laborieuses pour évaluer l’activité des composés contre les formes intracellulaires du parasite ou pour effectuer des essais in vivo . Dans ce travail, nous décrivons la génération de souches de L. panamensis et de L. donovani avec expression constitutive du gène qui code pour une protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) intégrée dans le locus codant pour l’ARNr 18S (ssu). Le gène codant pour eGFP a été obtenu à partir d’un vecteur commercial et amplifié par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour l’enrichir et ajouter des sites de restriction pour les enzymes BglII et KpnI. L’amplicon eGFP a été isolé par purification en gel d’agarose, digéré avec les enzymes BglII et KpnI, et ligaturé dans le vecteur d’expression de Leishmania pLEXSY-sat2.1 précédemment digéré avec le même ensemble d’enzymes. Le vecteur d’expression avec le gène cloné a été propagé dans E. coli, purifié, et la présence de l’insert a été vérifiée par PCR de colonie. Le plasmide purifié a été linéarisé et utilisé pour transfecter les parasites L. donovani et L . panamensis. L’intégration du gène a été vérifiée par PCR. L’expression du gène eGFP a été évaluée par cytométrie en flux. Les parasites fluorescents ont été clonés par dilution limitante, et les clones ayant l’intensité de fluorescence la plus élevée ont été sélectionnés par cytométrie de flux.
Introduction
Les parasites protozoaires du genre Leishmania provoquent la leishmaniose, une maladie avec un large éventail de manifestations cliniques. Cette maladie est répandue dans 98 pays, et son incidence annuelle est estimée entre 0,9 et 1,6 million de cas1. Les espèces de Leishmania pathogènes pour l’homme sont divisées en deux sous-genres, à savoir L. (Leishmania) et L. (Viannia). Infection par certaines espèces appartenant au L. Les sous-genres (Leishmania), tels que L. donovani et L. infantum, peuvent entraîner une leishmaniose viscérale (LV), qui est mortelle si elle n’est pas traitée2. Espèces appartenant au L. Le sous-genre (Viannia) est associé à la plupart des cas de leishmaniose cutanée (CL) et de leishmaniose cutanéo-muqueuse (LCM) en Amérique centrale et du Sud, en particulier au Panama, en Colombie et au Costa Rica, L. panamensis étant le principal agent étiologique de ces présentations cliniques 3,4.
La chimiothérapie anti-leishmania existante qui comprend des médicaments tels que les antimoniaux pentavalents, la miltefosine et l’amphotéricine B est très toxique et coûteuse. En outre, l’augmentation de la résistance aux médicaments au cours des dernières décennies s’est ajoutée aux facteurs qui interfèrent avec le traitement efficace des patients dans le mondeentier 5. Des différences substantielles ont été démontrées entre les espèces du genre Leishmania en ce qui concerne la sensibilité aux médicaments, en particulier entre les espèces du Nouveau Mondeet de l’Ancien Monde 6,7. Pour ces raisons, il est nécessaire de concentrer les efforts sur l’identification et le développement de nouveaux médicaments anti-leishmania, en accordant une attention particulière aux approches spécifiques aux espèces. L’étude de grandes bibliothèques de candidats médicaments avec des méthodologies traditionnelles est assez difficile, étant donné que ces méthodologies sont très laborieuses pour évaluer l’activité des composés contre les amastigotes intracellulaires ou pour réaliser des expériences in vivo 8 ; Par conséquent, il a été nécessaire de développer de nouvelles techniques qui réduisent ces inconvénients, y compris la mise en œuvre de gènes rapporteurs et le développement de tests de dépistage phénotypiques à haut contenu9.
L’utilisation de gènes rapporteurs a montré le potentiel d’accroître l’efficacité du processus de criblage des médicaments, car elle facilite le développement de tests à haut débit et in vivo. Des parasites Leishmania recombinants exprimant plusieurs gènes rapporteurs ont été générés par divers groupes de recherche. Des gènes rapporteurs, tels que la β-galactosidase, la β-lactamase et la luciférase, ont été introduits chez plusieurs espèces de Leishmania à l’aide de vecteurs épisomiques, montrant une utilité limitée pour le dépistage de médicaments dans les formes extra- et intracellulaires du parasite 10,11,12,13,14,15. Ces approches ont la limitation de nécessiter une forte pression sélective en culture pour éviter l’élimination de la construction épisomique, ainsi que l’utilisation de réactifs supplémentaires pour révéler l’activité du gène rapporteur. Inversement, la protéine fluorescente verte (GFP) et sa variante, la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), ont été utilisées dans la génération d’un grand nombre de souches transgéniques de Leishmania pour des tests de criblage de médicaments in vitro en raison de leur flexibilité et de leur sensibilité, ainsi que de la possibilité d’automatiser le processus de criblage par cytométrie en flux ou fluorométrie15, 16,17,18,19. Malgré des résultats prometteurs, les cultures de ces souches transgéniques étaient très hétérogènes dans leurs niveaux de fluorescence, car le nombre de copies du gène GFP n’était pas le même chez tous les parasites. De plus, le maintien de la fluorescence nécessitait une pression sélective constante sur les parasites en culture, puisque le gène GFP a été introduit dans une construction épisomique.
Pour les raisons mentionnées précédemment, de nombreux efforts ont été consacrés à la mise au point de nouvelles méthodologies pour la production de souches recombinantes stables. Ces efforts ont principalement reposé sur l’intégration de gènes rapporteurs dans les loci ribosomiques, en tirant parti des taux de transcription plus élevés des gènes ribosomales20. Des souches de L. infantum et de L. amazonensis ont été générées après avoir intégré les gènes codant pour la β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP22 et tdTomato23, et leur utilité a été évaluée dans les tests de dépistage de médicaments. Divers groupes ont développé des souches de L. donovani qui expriment la GFP de manière constitutive en intégrant son gène codant dans le locus de l’ARN ribosomique 18S (locus ssu) par recombinaison homologue24,25; ils ont montré une expression stable et homogène de la GFP dans la population transfectée, y compris les amastigotes intracellulaires 24,25, et ils ont été mis en œuvre avec succès dans les tests de dépistage de médicaments24,25,26. Bolhassani et coll.27 ont mis au point des souches de L. major et de L. infantum exprimant la GFP sous forme de transgène intégré. Ils ont utilisé le vecteur d’intégration pLEXSY, conçu à l’origine pour l’expression transgénique de protéines dans un système utilisant L. tarentolae comme hôte28. Le vecteur pLEXSY-GFP s’est révélé très efficace pour la génération de différentes souches de Leishmania exprimant constitutivement GFP 24,25,27,29,30. Chez ces parasites, la fluorescence est homogène et maintenue dans les formes intracellulaires, pouvant être détectée dans les lésions plantaires de souris infectées27.
Dans ce travail, nous décrivons la méthodologie utilisée pour générer des souches de L. panamensis et de L . donovani exprimant le gène codant pour eGFP en tant que transgène intégré à l’aide du système pLEXSY. Les souches générées par ce procédé sont utilisées dans notre laboratoire pour effectuer des tests de criblage de médicaments qui évaluent l’activité anti-leishmania potentielle de molécules d’origine naturelle et synthétique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les avantages et les inconvénients de divers gènes rapporteurs ont été étudiés chez plusieurs parasites protozoaires. Parmi eux, GFP et eGFP sont intrinsèquement fluorescents et permettent une quantification et une imagerie faciles. L’activité fluorescente de ces protéines peut être détectée avec une manipulation minimale à l’aide de la microscopie à fluorescence, de la fluorimétrie ou de la cytométrie en flux. Peu d’études ont été réalisées pour générer une L exprimant la GFP. (…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panama, numéro de subvention NI-177-2016, et Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panama, numéros de subvention SNI-169-2018, SNI-008-2022 et SNI-060-2022.
Materials
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
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