התפתחות זני לישמניה עם ביטוי מכונן של eGFP

Summary

במאמר זה נתאר את המתודולוגיה ששימשה ליצירת הזנים L. panamensis ו-L . donovani המבטאים את הגן ל-eGFP כטרנסגן משולב יציב באמצעות מערכת pLEXSY. טפילים נגועים שובטו על ידי הגבלת דילול, ושיבוטים בעלי עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר בשני המינים נבחרו לשימוש נוסף בבדיקות סינון תרופות.

Abstract

טפילים פרוטוזואניים מהסוג לישמניה גורמים ללישמניאזיס , מחלה בעלת ביטויים קליניים משתנים המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם. זיהום עם L. donovani יכול לגרום למחלה קרבית קטלנית. בפנמה, קולומביה וקוסטה ריקה, L. panamensis אחראי לרוב המקרים המדווחים של לישמניאזיס עורית ורירית. לימוד מספר רב של מועמדים לתרופות עם המתודולוגיות הזמינות עד כה הוא די קשה, בהתחשב בכך שהם מייגעים מאוד להערכת הפעילות של תרכובות נגד צורות תאיות של הטפיל או לביצוע בדיקות in vivo . בעבודה זו אנו מתארים את הדור של הזנים L. panamensis ו-L. donovani עם ביטוי מכונן של הגן המקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) המשולב בלוקוס המקודד ל-18S rRNA (ssu). הגן המקודד eGFP התקבל מווקטור מסחרי והוגבר על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להעשיר אותו ולהוסיף אתרי הגבלה לאנזימים BglII ו-KpnI. האמפליקון eGFP בודד על ידי טיהור ג’ל אגרוז, עוכל עם האנזימים BglII ו-KpnI, ונקשר לווקטור ביטוי הלישמניה pLEXSY-sat2.1 שעוכל בעבר עם אותה קבוצה של אנזימים. וקטור הביטוי עם הגן המשובט הופץ ב- E. coli, מטוהר, ונוכחות העלון אומתה על ידי PCR המושבה. הפלסמיד המטוהר היה ליניארי ושימש להעברת טפילי L. donovani ו – L. panamensis. שילוב הגן אומת על ידי PCR. הביטוי של הגן eGFP הוערך על ידי ציטומטריית זרימה. טפילים פלואורסצנטיים שובטו על ידי הגבלת דילול, ושיבוטים בעלי עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר נבחרו באמצעות ציטומטריית זרימה.

Introduction

טפילים פרוטוזואניים מהסוג לישמניה גורמים ללישמניאזיס, מחלה בעלת מגוון רחב של ביטויים קליניים. מחלה זו נפוצה ב-98 מדינות, ושכיחותה השנתית נאמדת ב-0.9 עד 1.6 מיליון מקרים¹. מיני לישמניה שהם פתוגניים לבני אדם מחולקים לשני תת-סוגים, כלומר L. (לישמניה) ול’. (ויאניה). זיהום עם כמה מינים השייכים L. תת-סוג (לישמניה), כגון L. donovani ו-L. infantum, עלול לגרום ללישמניאזיס ויסצרלי (VL), שהוא קטלני אם אינו מטופל². מינים השייכים ל– L. תת-סוג (Viannia) קשור לרוב המקרים של לישמניאזיס עורי (CL) ולישמניאזיס רירית (MCL) במרכז ודרום אמריקה, במיוחד בפנמה, קולומביה וקוסטה ריקה, כאשר L. panamensis הוא הסוכן האטיולוגי העיקרי של מצגות קליניות אלה ^3,4.

כימותרפיה קיימת נגד לישמניה הכוללת תרופות כגון אנטימוניאלים מחומשים, מילטפוסין ואמפוטריצין B היא רעילה מאוד ויקרה. יתר על כן, עמידות מוגברת לתרופות בעשורים האחרונים נוספה לגורמים המפריעים לטיפול יעיל בחולים ברחבי העולם⁵. הבדלים משמעותיים הודגמו בין מינים בסוג לישמניה ביחס לרגישות לתרופות, במיוחד בין מינים בעולם החדש והישן ^6,7. מסיבות אלה, יש צורך להפנות מאמצים לזיהוי ופיתוח של תרופות חדשות נגד לישמניה, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לגישות ספציפיות למינים. לימוד ספריות גדולות של מועמדים לתרופות עם מתודולוגיות מסורתיות הוא די קשה, בהתחשב בכך מתודולוגיות אלה הם מאוד מייגע להערכת הפעילות של תרכובות נגד amastigotes תאית או לביצוע ניסויים in vivo ⁸; לכן, היה צורך לפתח טכניקות חדשות המפחיתות חסרונות אלה, כולל יישום גנים של כתב ופיתוח בדיקות סינון פנוטיפיות בעלות תוכן גבוה⁹.

השימוש בגנים של כתבים הראה את הפוטנציאל להגביר את היעילות של תהליך סינון התרופות מכיוון שהוא מאפשר פיתוח של מבחני תפוקה גבוהה ו– in vivo. טפילי לישמניה רקומביננטיים המבטאים מספר גנים של כתבים נוצרו על ידי קבוצות מחקר שונות. גנים עיתונאיים, כגון β-גלקטוזידאז, β-לקטמאז ולוציפראז, הוכנסו למספר מיני לישמניה באמצעות וקטורים אפיזומליים, והראו תועלת מוגבלת לבדיקת תרופות בצורות חוץ-תאיות ותוך-תאיות של הטפיל 10,11,12,13,14,15. גישות אלה יש את המגבלה של דרישת לחץ סלקטיבי חזק בתרבית כדי למנוע חיסול של המבנה האפיזומלי, כמו גם את השימוש בריאגנטים נוספים כדי לחשוף את הפעילות של הגן המדווח. לעומת זאת, החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) וגרסתו, החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר (eGFP), שימשו ביצירת מספר רב של זני לישמניה טרנסגניים לבדיקות סקר תרופות חוץ גופיות בשל גמישותם ורגישותם, כמו גם האפשרות להפוך את תהליך הסינון לאוטומטי באמצעות ציטומטריית זרימה או פלואורומטריה^{15, 16,17,18,19}. למרות התוצאות המבטיחות, תרביות של זנים טרנסגניים אלה היו הטרוגניות מאוד ברמות הפלואורסצנטיות שלהם, שכן מספר העותקים של הגן GFP לא היה זהה בכל הטפילים. יתר על כן, שמירה על פלואורסצנטיות דרשה לחץ סלקטיבי מתמיד על הטפילים בתרבית, שכן הגן GFP הוכנס במבנה אפיזומלי.

מהסיבות שצוינו קודם לכן, מאמצים רבים התמקדו בפיתוח מתודולוגיות חדשות לייצור זנים רקומביננטיים יציבים. מאמצים אלה הסתמכו בעיקר על שילוב של גנים מדווחים לתוך loci ריבוזומלי, תוך ניצול שיעורי השעתוק הגבוהים יותר של גנים ריבוזומליים²⁰. זנים של L. infantum ו- L. amazonensis נוצרו לאחר ששילבו את הגנים המקודדים עבור β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP²² ו- tdTomato²³, והם הוערכו על יעילותם בבדיקות סינון תרופות. קבוצות שונות פיתחו זני L. donovani המבטאים GFP באופן קונסטיטוטיבי על ידי שילוב גן הקידוד שלו בלוקוס RNA ריבוזומלי 18S (ssu locus) באמצעות רקומבינציה הומולוגית^24,25; הם הראו ביטוי GFP יציב והומוגני באוכלוסייה הנגועה, כולל אמסטיגוטים תוך-תאיים 24,25, והם יושמו בהצלחה בבדיקות סקר תרופות^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 פיתחו זנים של L. major ו– L. infantum המבטאים GFP כטרנסגן משולב. הם השתמשו בווקטור האינטגרציה pLEXSY, שתוכנן במקור עבור ביטוי מהונדס של חלבונים במערכת באמצעות L. tarentolae כמארח²⁸. וקטור pLEXSY-GFP הוכח כיעיל מאוד ליצירת זני לישמניה שונים המבטאים באופן מכונן GFP 24,25,27,29,30. בטפילים אלה, פלואורסצנטיות היא הומוגנית ומתוחזקת בצורות תוך תאיות, להיות מסוגל להיות מזוהה נגעים כרית רגל של עכברים נגועים²⁷.

בעבודה זו, אנו מתארים את המתודולוגיה המשמשת ליצירת זנים L. panamensis ו- L. donovani המבטאים את הגן המקודד ל- eGFP כטרנסגן משולב באמצעות מערכת pLEXSY. הזנים הנוצרים בתהליך זה משמשים במעבדה שלנו לביצוע בדיקות סינון תרופות המעריכות את הפעילות האנטי-לישמניה הפוטנציאלית של מולקולות ממקור טבעי וסינתטי.

Protocol

כדי לשמור על הדגימות סטריליות, כל השלבים הכוללים תרבית טפילים צריכים להתבצע בתוך מכסה מנוע ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) או על פי תקנות הבריאות והבטיחות המקומיות. סיכום גרפי של פרוטוקול זה ניתן למצוא באיור 1. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_u…

Representative Results

לאחר בניית מבנה pLEXSY-eGFP והפיכת תאי E. coli מוכשרים, מושבות המכילות את המבנה עם תוספת eGFP יפיקו תוצר של כ- 859 bp לאחר הפעלת PCR המושבה המתואר בסעיף 1.2 (איור 3A). עיכול כולל של הפלסמיד המטוהר ממושבות חיוביות באמצעות SwaI צריך לתת שני מקטעים אופייניים באלקטרופורזה של ג’ל, מקטע 2.9 kbp …

Discussion

היתרונות והחסרונות של גנים שונים נחקרו במספר טפילים פרוטוזואים. ביניהם, GFP ו- eGFP הם פלואורסצנטיים במהותם ומאפשרים כימות והדמיה קלים. ניתן לזהות את הפעילות הפלואורסצנטית של חלבונים אלה עם מניפולציה מינימלית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, פלואורימטריה או ציטומטריית זרימה. מחקרים מעטים בו?…

Materials

96 Well Microplates	Corning	CLS3340	Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid
Agarose	Sigma-Aldrich	A4718
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, suitable for cell culture
BglII restriction enzyme	New England BioLabs	R0144S	2,000 units. 10,000 units/mL
Cell Culture Flasks	Corning	CLS430168	Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Not available
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524
Gel Loading Buffer	Sigma-Aldrich	G2526	The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading.
Gene Pulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber.
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes	Bio-Rad	1652086	Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Inverted microscope	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF restriction enzyme	New England BioLabs	R3142S	4,000 units. 20,000 units/mL
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147	Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture.
LB Broth	Sigma-Aldrich	L2542	Liquid microbial growth medium
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1640300	Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence
pLEXSYcon2.1 expression kit	Jena Bioscience	EGE-1310sat	Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.
Potassium Chloride	Millipore	529552	Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures.
Schneider′s Insect Medium	Sigma-Aldrich	S0146	Medium used in our laboratory for culturing Leishmania.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration)
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzyme	New England BioLabs	R0604S	2,000 units. 10,000 units/mL
Syringe filters	Corning	CLS431212	regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends
Tris-Borate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA.