eGFPの構成的発現を有する リーシュマニア 種株の開発
Summary
ここでは、pLEXSYシステムを用いてeGFPの遺伝子を安定な統合導入遺伝子として発現するL. パナメンシス 株および L.ドノバニ 株を作製するために用いられる方法論について述べる。トランスフェクトされた寄生虫を限界希釈によってクローニングし、両方の種で最も高い蛍光強度を有するクローンを、薬物スクリーニングアッセイでさらに使用するために選択しました。
Abstract
リーシュマニア属の原虫寄生虫は、世界中の何百万人もの人々に影響を与えるさまざまな臨床症状を伴う疾患であるリーシュマニア症を引き起こします。L.ドノバニに感染すると、致命的な内臓疾患を引き起こす可能性があります。パナマ、コロンビア、コスタリカでは、L. panamensisが皮膚および粘膜皮膚リーシュマニア症の報告された症例のほとんどに関与しています。これまでに利用可能な方法論で多数の薬物候補を研究することは、細胞内形態の寄生虫に対する化合物の活性を評価するため、またはin vivoアッセイを実行するために非常に面倒であることを考えると、非常に困難です。この研究では、18S rRNA(ssu)をコードする遺伝子座に組み込まれた増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)をコードする遺伝子の構成的発現を伴うL.パナメンシス株およびL.ドノバニ株の生成について説明します。eGFPをコードする遺伝子を市販のベクターから取得し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅して濃縮し、BglIIおよびKpnI酵素の制限部位を追加しました。eGFPアンプリコンをアガロースゲル精製により単離し、酵素BglIIおよびKpnIで消化し、同じ酵素セットで以前に消化したリーシュマニア発現ベクターpLEXSY-sat2.1にライゲーションしました。クローニングした遺伝子を有する発現ベクターを大腸菌内で増殖させ、精製し、インサートの存在をコロニーPCRにより検証した。精製したプラスミドを直鎖化し、L. donovaniおよびL. panamensis寄生虫のトランスフェクションに使用した。遺伝子の組み込み性はPCRによって検証された。eGFP遺伝子の発現をフローサイトメトリーにより評価した。蛍光寄生虫を限界希釈によってクローニングし、蛍光強度が最も高いクローンをフローサイトメトリーを用いて選択した。
Introduction
リーシュマニア属の原虫寄生虫は、広範囲の臨床症状を伴う疾患であるリーシュマニア症を引き起こす。この病気は98カ国で流行しており、年間発生率は0.9〜160万例と推定されています1。人間に病原性のあるリーシュマニア種は、2つの亜属、すなわちLに分けられます。(リーシュマニア)とL。(ヴィアンニア)。Lに属するいくつかの種による感染。L. donovaniやL. ininftumなどの(リーシュマニア)亜属は、内臓リーシュマニア症(VL)を引き起こす可能性があり、治療せずに放置すると致命的です2。Lに属する種。(Viannia)亜属は、中南米、特にパナマ、コロンビア、コスタリカの皮膚リーシュマニア症(CL)および粘膜皮膚リーシュマニア症(MCL)のほとんどの症例に関連しており、L.パナメンシスがこれらの臨床症状の主な病因物質です3,4。
五価アンチモン、ミルテフォシン、アムホテリシンBなどの薬剤を含む既存の抗リーシュマニア化学療法は、毒性が高く、高価です。さらに、ここ数十年間の薬剤耐性の増加は、世界中の患者の効果的な治療を妨げる要因に追加されています5。リーシュマニア属の種間、特に新世界と旧世界の種の間で、薬物感受性に関して実質的な違いが示されています6,7。これらの理由から、種固有のアプローチに特に注意を払いながら、新しい抗リーシュマニア薬の同定と開発に努力する必要があります。従来の方法論で医薬品候補の大規模なライブラリを研究することは、これらの方法論が細胞内アマスティゴテスに対する化合物の活性を評価するため、またはin vivo実験を実行するために非常に面倒であることを考えると、非常に困難です8。したがって、レポーター遺伝子の実装やハイコンテント表現型スクリーニングアッセイの開発など、これらの欠点を軽減する新しい技術を開発する必要がありました9。
レポーター遺伝子の使用は、ハイスループットおよびin vivoアッセイの開発を容易にするため、薬物スクリーニングプロセスの効率を高める可能性を示しています。いくつかのレポーター遺伝子を発現する組換えリーシュマニア寄生虫は、さまざまな研究グループによって生成されています。β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子は、エピソーマルベクターを用いていくつかのリーシュマニア種に導入されており、寄生虫の細胞外および細胞内形態での薬物スクリーニングには限られた有用性が示されています10,11,12,13,14,15.これらのアプローチには、エピソーム構築物の排除を避けるために培養中に強い選択圧が必要であること、およびレポーター遺伝子の活性を明らかにするための追加の試薬の使用が必要であるという制限があります。逆に、緑色蛍光タンパク質(GFP)およびその変異体である増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)は、その柔軟性および感度、ならびにフローサイトメトリーまたは蛍光測定を用いたスクリーニングプロセスを自動化する可能性のために、in vitro薬物スクリーニングアッセイのための多数のトランスジェニックリーシュマニア株の生成に使用されてきた15、 16、17、18、19。有望な結果にもかかわらず、これらのトランスジェニック株の培養物は、GFP遺伝子のコピー数がすべての寄生虫で同じではなかったため、蛍光レベルが非常に不均一でした。さらに、蛍光を維持するには、GFP遺伝子がエピソーム構築物に導入されたため、培養中の寄生虫に対して一定の選択圧が必要でした。
前述の理由から、多くの努力が安定した組換え株を生産するための新しい方法論の開発に焦点を合わせてきました。これらの努力は、リボソーム遺伝子のより高い転写率を利用して、リボソーム遺伝子座へのレポーター遺伝子の統合に大きく依存してきました20。β-ガラクトシダーゼ21、IFP 1.4、iRFP22、tdTomato23をコードする遺伝子を組み込んだL. infantumおよびL. amazonensis株を作製し、薬物スクリーニングアッセイにおける有用性を評価しています。さまざまなグループが、相同組換えを介してそのコード遺伝子を18SリボソームRNA遺伝子座(ssu遺伝子座)に組み込むことにより、GFPを構成的に発現するL.ドノバニ株を開発しました24,25;それらは、細胞内アマスティゴテスを含むトランスフェクトされた集団において安定した均一なGFP発現を示し24,25、そしてそれらは薬物スクリーニングアッセイ24,25,26において首尾よく実施された。Bolhassaniら27は、組み込み導入遺伝子としてGFPを発現するL.メジャーおよびL.インファンタムの株を開発しました。彼らは、もともとL.タレントラエを宿主として使用するシステムにおけるタンパク質のトランスジェニック発現のために設計された組み込みベクターpLEXSYを使用しました28。pLEXSY-GFPベクターは、GFP24、25、27、29、30を構成的に発現する異なるリーシュマニア株の生成に非常に効率的であることが示されています。これらの寄生生物において、蛍光は均質であり、細胞内形態で維持され、感染したマウスの足蹠病変において検出することができる27。
本研究では、pLEXSYシステムを用いて、eGFPをコードする遺伝子を統合導入遺伝子として発現するL. パナメンシス 株および L.ドノバニ 株を作製するために使用される方法論について説明します。このプロセスで生成された菌株は、天然および合成起源の分子の潜在的な抗リーシュマニア活性を評価する薬物スクリーニングアッセイを実行するために私たちの研究室で使用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
様々なレポーター遺伝子の長所と短所は、いくつかの原虫寄生虫で研究されています。その中で、GFPとeGFPは本質的に蛍光であり、定量とイメージングが容易です。これらのタンパク質の蛍光活性は、蛍光顕微鏡、蛍光測定、またはフローサイトメトリーを用いた最小限の操作で検出できます。GFP発現Lを生成するための研究はほとんど行われていない。(Viannia)株は、旧世界リ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、パナマ州の国立科学技術(SENACYT)(助成金番号NI-177-2016)およびパナマ州の国立調査事務局(SNI)(助成金番号SNI-169-2018、SNI-008-2022、およびSNI-060-2022)によって資金提供されました。
Materials
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
Referências
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).
- Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243 (2020).
- Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
- Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266 (2016).
- Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
- Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
- Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
- Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
- Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
- Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
- Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
- Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
- Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
- Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).
- García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).
- Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
- De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771 (2015).
- Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
- Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
- Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
- Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
- Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , (2012).
- Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
- Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
- Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).
- Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
- Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).
