eGFP의 구성적 발현을 통한 리슈만편모충 종 균주의 개발
Summary
여기에서는 pLEXSY 시스템을 사용하여 안정적인 통합 이식 유전자로서 eGFP에 대한 유전자를 발현하는 L . panamensis 및 L . donovani 균주를 생성하는 데 사용되는 방법론을 설명합니다. 형질주입된 기생충은 희석을 제한하여 클로닝하고, 두 종 모두에서 가장 높은 형광 강도를 갖는 클론을 약물 스크리닝 분석에 추가로 사용하기 위해 선택했습니다.
Abstract
리슈만편모충 속의 원생동물 기생충은 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 다양한 임상 증상을 보이는 질병인 리슈만편모충증을 유발합니다. L. donovani에 감염되면 치명적인 내장 질환이 발생할 수 있습니다. 파나마, 콜롬비아 및 코스타리카에서 L. panamensis는 보고된 피부 및 피부 점막 리슈만편모충증 사례의 대부분을 담당합니다. 현재까지 이용 가능한 방법론으로 많은 수의 약물 후보를 연구하는 것은 세포 내 형태의 기생충에 대한 화합물의 활성을 평가하거나 생체 내 분석을 수행하는 데 매우 힘들다는 점을 감안할 때 매우 어렵습니다. 이 연구에서 우리는 18S rRNA(ssu)를 암호화하는 유전자좌에 통합된 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 암호화하는 유전자의 구성적 발현을 가진 L. panamensis 및 L. donovani 균주의 생성을 설명합니다. eGFP를 코딩하는 유전자는 상용 벡터에서 얻었고 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되어 이를 풍부하게 하고 BglII 및 KpnI 효소에 대한 제한 부위를 추가했습니다. eGFP 앰플리콘을 아가로스 겔 정제에 의해 분리하고, 효소 BglII 및 KpnI로 분해하고, 이전에 동일한 효소 세트로 소화된 리슈만편모충 발현 벡터 pLEXSY-sat2.1에 결찰했습니다. 클로닝된 유전자를 가진 발현 벡터를 대장균에 증식시키고, 정제하고, 삽입물의 존재 여부를 콜로니 PCR로 검증하였다. 정제된 플라스미드를 선형화하고, L. donovani 및 L. panamensis 기생충을 형질감염시키는데 사용하였다. 유전자의 통합은 PCR에 의해 검증되었다. eGFP 유전자의 발현을 유세포 분석기로 평가하였다. 형광 기생충은 제한 희석에 의해 클로닝되었고, 형광 강도가 가장 높은 클론은 유세포 분석을 사용하여 선택되었습니다.
Introduction
리슈만편모충 속의 원생동물 기생충은 광범위한 임상 증상을 보이는 질병인 리슈만편모충증을 유발합니다. 이 질병은 98개국에서 유행하고 있으며, 연간 발병률은 0.9-160만 명으로 추산된다1. 인간에게 병원성인 리슈만편모충 종은 두 개의 아속, 즉 L로 나뉩니다. (리슈만편모충)과 L. (비아니아). L에 속하는 일부 종의 감염. L. donovani와 L. infantum과 같은 (리슈만편모충증) 아속은 내장 리슈만편모충증(VL)을 유발할 수 있으며, 이는 치료하지 않고 방치하면 치명적이다2. L에 속하는 종. (Viannia) 아속은 중남미, 특히 파나마, 콜롬비아 및 코스타리카에서 피부 리슈만편모충증(CL) 및 피부 점막만편모충증(MCL)의 대부분의 사례와 관련이 있으며, L. panamensis는 이러한 임상 증상의 주요 병인이다 3,4.
5가 항몬제, 밀테포신 및 암포테리신 B와 같은 약물을 포함하는 기존의 항리슈만편모충 화학요법은 독성이 강하고 비용이 많이 듭니다. 또한, 최근 수십 년 동안 증가된 약물 내성이 전 세계적으로 환자의 효과적인 치료를 방해하는 요인에 추가되었다5. 약물 감수성과 관련하여 Leishmania 속의 종들, 특히 신세계 종과 구세계 종 6,7 사이에 상당한 차이가 입증되었습니다. 이러한 이유로 종별 접근법에 특별한주의를 기울여 새로운 항 리슈 마니아 약물의 식별 및 개발에 노력을 기울일 필요가 있습니다. 전통적인 방법론으로 약물 후보의 대규모 라이브러리를 연구하는 것은 매우 어려운데, 이러한 방법론은 세포 내 무염증에 대한 화합물의 활성을 평가하거나 생체 내 실험을 수행하는 데 매우 힘들다8. 따라서 리포터 유전자의 구현 및 고함량 표현형 스크리닝 분석법의 개발을 포함하여 이러한 단점을 줄이는 새로운 기술을 개발할 필요가 있었습니다9.
리포터 유전자의 사용은 고처리량 및 생체 내 분석의 개발을 용이하게 하므로 약물 스크리닝 프로세스의 효율성을 높일 수 있는 가능성을 보여주었습니다. 여러 리포터 유전자를 발현하는 재조합 리슈만편모충 기생충이 다양한 연구 그룹에 의해 생성되었습니다. β-갈락토시다아제, β-락타마제, 루시페라제와 같은 리포터 유전자는 에피솜 벡터를 사용하여 여러 리슈만편모충 종에 도입되었으며, 기생충10,11,12,13,14,15의 세포외 및 세포내 형태에서 약물 스크리닝에 제한적인 유용성을 보여줍니다 . 이러한 접근법은 에피솜 구조의 제거를 피하기 위해 배양에서 강력한 선택 압력을 요구하고 리포터 유전자의 활성을 밝히기 위해 추가 시약을 사용해야 한다는 한계가 있습니다. 반대로, 녹색 형광 단백질(GFP)과 그 변이체인 강화 녹색 형광 단백질(eGFP)은 유연성과 민감성뿐만 아니라 유세포 분석 또는 형광 측정법을 사용하여 스크리닝 프로세스를 자동화할 수 있는 가능성으로 인해 시험관 내 약물 스크리닝 분석을 위한 많은 형질전환 리슈만편모충 균주의 생성에 사용되었습니다15. 16,17,18,19. 유망한 결과에도 불구하고, 이러한 형질전환 균주의 배양은 GFP 유전자의 사본 수가 모든 기생충에서 동일하지 않았기 때문에 형광 수준에서 매우 이질적이었습니다. 또한, 형광을 유지하려면 GFP 유전자가 에피솜 구조에 도입되었기 때문에 배양 중인 기생충에 대한 지속적인 선택 압력이 필요했습니다.
앞서 언급한 이유로 인해 안정적인 재조합 균주를 생산하기 위한 새로운 방법론을 개발하는 데 많은 노력이 집중되어 왔습니다. 이러한 노력은 리보솜 유전자의 더 높은 전사율을 이용하여 리보솜 유전자좌에 리포터 유전자를 통합하는 데 주로 의존해 왔다20. L. infantum 및 L. amazonensis의 균주는 β-갈락토시다아제 21, IFP 1.4, iRFP 22 및 tdTomato23을 암호화하는 유전자를 통합하여 생성되었으며 약물 스크리닝 분석에서 유용성에 대해 평가되었습니다. 다양한 그룹이 상동 재조합을 통해 코딩 유전자를 18S 리보솜 RNA 유전자좌(ssu locus)에 통합하여 GFP를 구성적으로 발현하는 L. donovani 균주를 개발했습니다24,25; 그들은 세포내 amastigotes 24,25를 포함하여 형질감염된 집단에서 안정적이고 균질한 GFP 발현을 보였으며 약물 스크리닝 분석에서 성공적으로 구현되었습니다24,25,26. Bolhassani et al.27은 GFP를 통합 이식 유전자로 발현하는 L. major 및 L. infantum의 균주를 개발했습니다. 연구진은 원래 L. tarentolae를 숙주로 사용하는 시스템에서 단백질의 형질전환 발현을 위해 설계된 통합 벡터 pLEXSY를 사용했다28. pLEXSY-GFP 벡터는 GFP 24,25,27,29,30을 구성적으로 발현하는 다양한 리슈만편모충 균주의 생성에 매우 효율적인 것으로 나타났습니다. 이들 기생충에서, 형광은 균질하고 세포내 형태로 유지되며, 감염된 생쥐의 발바닥 병변에서 검출될 수 있다27.
이 연구에서 우리는 pLEXSY 시스템을 사용하여 eGFP를 암호화하는 유전자를 통합 이식 유전자로 발현하는 L . panamensis 및 L . donovani 균주를 생성하는 데 사용되는 방법론을 설명합니다. 이 과정을 통해 생성된 균주는 천연 및 합성 기원 분자의 잠재적인 항리슈만편모충 활성을 평가하는 약물 스크리닝 분석을 수행하기 위해 실험실에서 사용됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다양한 리포터 유전자의 장점과 단점은 여러 원생동물 기생충에서 연구되었습니다. 그 중 GFP와 eGFP는 본질적으로 형광성이며 정량화 및 이미징이 용이합니다. 이러한 단백질의 형광 활성은 형광 현미경, 형광 측정 또는 유세포 분석을 사용하여 최소한의 조작으로 검출할 수 있습니다. GFP 발현 L을 생성하기 위한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. (Viannia) 균주는, GFP 및 그 유도체의 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, 보조금 번호 NI-177-2016 및 Sistema Nacional de Investigación (SNI), 파나마, 보조금 번호 SNI-169-2018, SNI-008-2022 및 SNI-060-2022.
Materials
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
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