Utvikling av Leishmania-artsstammer med konstitutivt uttrykk for eGFP

Summary

Her beskriver vi metodikken som brukes til å generere L. panamensis og L . donovani-stammer som uttrykker genet for eGFP som et stabilt integrert transgen ved hjelp av pLEXSY-systemet. Transfekterte parasitter ble klonet ved å begrense fortynning, og kloner med høyest fluorescensintensitet i begge arter ble valgt for videre bruk i screeninganalyser.

Abstract

Protozoan parasitter av slekten Leishmania forårsaker leishmaniasis , en sykdom med variable kliniske manifestasjoner som rammer millioner av mennesker over hele verden. Infeksjon med L. donovani kan føre til dødelig visceral sykdom. I Panama, Colombia og Costa Rica er L. panamensis ansvarlig for de fleste rapporterte tilfellene av kutan og mukokutan leishmaniasis. Det er ganske vanskelig å studere et stort antall legemiddelkandidater med metodene som er tilgjengelige til dags dato, gitt at de er svært arbeidskrevende for å evaluere aktiviteten til forbindelser mot intracellulære former av parasitten eller for å utføre in vivo-analyser . I dette arbeidet beskriver vi generasjonen av L. panamensis og L. donovani-stammer med konstitutivt uttrykk for genet som koder for et forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) integrert i stedet som koder for 18S rRNA (ssu). Genet som koder for eGFP ble oppnådd fra en kommersiell vektor og forsterket ved polymerasekjedereaksjon (PCR) for å berike den og legge til restriksjonssteder for BglII og KpnI enzymer. EGFP-amplikonen ble isolert ved agarosegelrensing, fordøyd med enzymene BglII og KpnI, og ligert inn i Leishmania-ekspresjonsvektoren pLEXSY-sat2.1 som tidligere ble fordøyd med samme sett med enzymer. Ekspresjonsvektoren med det klonede genet ble forplantet i E. coli, renset, og tilstedeværelsen av innsatsen ble verifisert ved koloni-PCR. Det rensede plasmidet ble linearisert og brukt til å transfektere L. donovani og L . panamensis parasitter. Integrasjonen av genet ble verifisert ved PCR. Ekspresjonen av eGFP-genet ble evaluert ved flowcytometri. Fluorescerende parasitter ble klonet ved å begrense fortynning, og kloner med høyest fluorescensintensitet ble valgt ved hjelp av flowcytometri.

Introduction

Protozoan parasitter av slekten Leishmania forårsaker leishmaniasis, en sykdom med et bredt spekter av kliniske manifestasjoner. Denne sykdommen er utbredt i 98 land, og den årlige forekomsten er estimert til 0,9 til 1,6 millioner tilfeller¹. Leishmania-arter som er patogene for mennesker er delt inn i to underslekter, nemlig L. (Leishmania) og L. (Viannia). Infeksjon med noen arter som tilhører L. (Leishmania) underslekt, som L. donovani og L. infantum, kan resultere i visceral leishmaniasis (VL), som er dødelig hvis den ikke behandles². Arter som tilhører L. (Viannia) underslekt er assosiert med de fleste tilfeller av kutan leishmaniasis (CL) og mukokutan leishmaniasis (MCL) i Sentral- og Sør-Amerika, spesielt i Panama, Colombia og Costa Rica, med L. panamensis som det viktigste etiologiske middelet for disse kliniske presentasjonene ^3,4.

Eksisterende anti-leishmania kjemoterapi som inkluderer stoffer som pentavalente antimonialer, miltefosin og amfotericin B er svært giftig og dyrt. Videre har økt legemiddelresistens de siste tiårene blitt lagt til faktorene som forstyrrer effektiv behandling av pasienter over hele verden⁵. Det er påvist betydelige forskjeller mellom artene i slekten Leishmania i forhold til legemiddelfølsomhet, spesielt mellom arter i den nye og den gamle verden ^6,7. Av disse grunner er det nødvendig å rette innsatsen mot identifisering og utvikling av nye anti-leishmania-legemidler, med spesiell oppmerksomhet på artsspesifikke tilnærminger. Det er ganske vanskelig å studere store biblioteker av legemiddelkandidater med tradisjonelle metoder, gitt at disse metodene er svært arbeidskrevende for å evaluere aktiviteten til forbindelser mot intracellulære amastigoter eller for å utføre in vivo-eksperimenter ⁸; Derfor har det vært nødvendig å utvikle nye teknikker som reduserer disse ulempene, inkludert implementering av reportergener og utvikling av fenotypiske screeninganalyser med høyt innhold⁹.

Bruken av reportergener har vist potensialet til å øke effektiviteten av narkotikascreeningsprosessen, da det letter utviklingen av høy gjennomstrømning og in vivo-analyser. Rekombinante Leishmania-parasitter som uttrykker flere reportergener har blitt generert av ulike forskningsgrupper. Reportergener, som β-galaktosidase, β-laktamase og luciferase, har blitt introdusert i flere Leishmania-arter ved hjelp av episomale vektorer, og viser begrenset nytte for legemiddelscreening i ekstra- og intracellulære former av parasitten 10,11,12,13,14,15. Disse tilnærmingene har begrensningen av å kreve et sterkt selektivt trykk i kultur for å unngå eliminering av den episomale konstruksjonen, samt bruk av ytterligere reagenser for å avsløre aktiviteten til reportergenet. Omvendt har det grønne fluorescerende proteinet (GFP) og dets variant, det forbedrede grønne fluorescerende proteinet (eGFP), blitt brukt i genereringen av et stort antall transgene Leishmania-stammer for in vitro legemiddelscreeningsanalyser på grunn av deres fleksibilitet og følsomhet, samt muligheten for å automatisere screeningprosessen ved bruk av flowcytometri eller fluorometri^{15, 16,17,18,19}. Til tross for lovende resultater var kulturer av disse transgene stammene svært heterogene i deres fluorescensnivåer, siden antall kopier av GFP-genet ikke var det samme i alle parasittene. Videre krevde opprettholdelse av fluorescens konstant selektivt trykk på parasittene i kultur, siden GFP-genet ble introdusert i en episomal konstruksjon.

Av de grunner som er nevnt tidligere, har mange anstrengelser fokusert på å utvikle nye metoder for å produsere stabile rekombinante stammer. Disse anstrengelsene har for det meste stått på integrering av reportergener i ribosomale loci, og utnyttet de høyere transkripsjonsratene av ribosomale gener²⁰. Stammer av L. infantum og L. amazonensis har blitt generert etter å ha integrert genene som koder for β-galaktocidase 21, IFP 1.4, iRFP²² og tdTomato²³, og de har blitt evaluert for deres nytte i legemiddelscreeningsanalyser. Ulike grupper har utviklet L. donovani-stammer som uttrykker GFP konstitutivt ved å integrere kodegenet i 18S ribosomalt RNA-lokus (ssu locus) gjennom homolog rekombinasjon^24,25; de viste stabilt og homogent GFP-uttrykk i den transfekterte populasjonen, inkludert intracellulære amastigoter 24,25, og de ble vellykket implementert i legemiddelscreeningsanalyser^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 utviklet stammer av L. major og L. infantum som uttrykker GFP som et integrert transgen. De brukte integrasjonsvektoren pLEXSY, opprinnelig designet for transgen ekspresjon av proteiner i et system med L. tarentolae som vert²⁸. pLEXSY-GFP-vektoren har vist seg å være svært effektiv for generering av forskjellige Leishmania-stammer som konstitutivt uttrykker GFP 24,25,27,29,30. I disse parasittene er fluorescens homogen og opprettholdes i de intracellulære formene, og kan detekteres i fotputeskader av infiserte mus²⁷.

I dette arbeidet beskriver vi metodikken som brukes for å generere L. panamensis og L . donovani-stammer som uttrykker genet som koder for eGFP som et integrert transgen ved hjelp av pLEXSY-systemet. Stammene som genereres gjennom denne prosessen, brukes i laboratoriet vårt for å utføre screeninganalyser som evaluerer den potensielle anti-leishmania-aktiviteten til molekyler av naturlig og syntetisk opprinnelse.

Protocol

For å holde prøvene sterile, bør alle trinn som involverer parasittkultur utføres inne i en hette på biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) eller i henhold til lokale helse- og sikkerhetsforskrifter. Et grafisk sammendrag av denne protokollen finnes i figur 1. Figur 1: Sammendragsskjema for protokollen for generering av eGFP-uttrykkend…

Representative Results

Etter å ha bygget pLEXSY-eGFP-konstruksjonen og transformert kompetente E. coli-celler, vil kolonier som inneholder konstruksjonen med eGFP-innsatsen generere et ca. 859 bp-produkt etter å ha kjørt koloni-PCR beskrevet i avsnitt 1.2 (figur 3A). Total fordøyelse av det rensede plasmidet fra positive kolonier ved bruk av SwaI skal gi to karakteristiske fragmenter i gelelektroforese, et 2,9 kbp-fragment som er den delen av PLEXSY-vektoren som inneholder alle nødvendige el…

Discussion

Fordeler og ulemper ved ulike reportergener har blitt studert hos flere protozoparasitter. Blant dem er GFP og eGFP iboende fluorescerende og tillater enkel kvantifisering og avbildning. Den fluorescerende aktiviteten til disse proteinene kan detekteres med minimal manipulering ved hjelp av fluorescensmikroskopi, fluorimetri eller flowcytometri. Få studier har blitt utført for å generere GFP-uttrykkende L. (Viannia) stammer, til tross for den demonstrerte robustheten til GFP og deres derivater som re…

Materials

96 Well Microplates	Corning	CLS3340	Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid
Agarose	Sigma-Aldrich	A4718
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, suitable for cell culture
BglII restriction enzyme	New England BioLabs	R0144S	2,000 units. 10,000 units/mL
Cell Culture Flasks	Corning	CLS430168	Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Not available
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524
Gel Loading Buffer	Sigma-Aldrich	G2526	The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading.
Gene Pulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber.
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes	Bio-Rad	1652086	Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Inverted microscope	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF restriction enzyme	New England BioLabs	R3142S	4,000 units. 20,000 units/mL
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147	Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture.
LB Broth	Sigma-Aldrich	L2542	Liquid microbial growth medium
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1640300	Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence
pLEXSYcon2.1 expression kit	Jena Bioscience	EGE-1310sat	Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.
Potassium Chloride	Millipore	529552	Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures.
Schneider′s Insect Medium	Sigma-Aldrich	S0146	Medium used in our laboratory for culturing Leishmania.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration)
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzyme	New England BioLabs	R0604S	2,000 units. 10,000 units/mL
Syringe filters	Corning	CLS431212	regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends
Tris-Borate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA.