Desenvolvimento de Cepas de Espécies de Leishmania com Expressão Constitutiva de eGFP

Summary

Aqui, descrevemos a metodologia usada para gerar cepas de L. panamensis e L . donovani expressando o gene para eGFP como um transgene integrado estável usando o sistema pLEXSY. Os parasitas transfectados foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência em ambas as espécies foram selecionados para uso posterior em ensaios de triagem de drogas.

Abstract

Protozoários parasitas do gênero Leishmania causam leishmaniose , doença com manifestações clínicas variáveis que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. A infecção por L. donovani pode resultar em doença visceral fatal. No Panamá, Colômbia e Costa Rica, L. panamensis é responsável pela maioria dos casos relatados de leishmaniose cutânea e mucocutânea. Estudar um grande número de candidatos a fármacos com as metodologias disponíveis até o momento é bastante difícil, uma vez que são muito trabalhosos para avaliar a atividade de compostos contra formas intracelulares do parasita ou para realizar ensaios in vivo . Neste trabalho, descrevemos a geração de cepas de L. panamensis e L. donovani com expressão constitutiva do gene que codifica para uma proteína fluorescente verde reforçada (eGFP) integrada ao locus que codifica para o 18S rRNA (ssu). O gene que codifica a eGFP foi obtido a partir de um vetor comercial e amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) para enriquecê-lo e adicionar sítios de restrição para as enzimas BglII e KpnI. O amplicon da eGFP foi isolado por purificação em gel de agarose, digerido com as enzimas BglII e KpnI e ligado ao vetor de expressão de Leishmania pLEXSY-sat2.1 previamente digerido com o mesmo conjunto de enzimas. O vetor de expressão com o gene clonado foi propagado em E. coli, purificado, e a presença da inserção foi verificada por PCR de colônia. O plasmídeo purificado foi linearizado e utilizado para transfectar os parasitas L. donovani e L . panamensis. A integração do gene foi verificada por PCR. A expressão do gene eGFP foi avaliada por citometria de fluxo. Os parasitas fluorescentes foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência foram selecionados por citometria de fluxo.

Introduction

Protozoários parasitas do gênero Leishmania causam leishmaniose, uma doença com uma ampla gama de manifestações clínicas. Essa doença é prevalente em 98 países, e sua incidência anual é estimada em 0,9 a 1,6 milhão de^casos1. As espécies de Leishmania patogênicas para o homem são divididas em dois subgêneros, a saber, L. (Leishmania) e L. (Viannia). Infecção por algumas espécies pertencentes à L. Subgêneros (Leishmania), como L. donovani e L. infantum, podem resultar em leishmaniose visceral (LV), que é fatal se não tratada². Espécies pertencentes ao L. Os subgêneros (Viannia) estão associados à maioria dos casos de leishmaniose cutânea (LC) e leishmaniose tegumentar americana (LCM) nas Américas Central e do Sul, particularmente no Panamá, Colômbia e Costa Rica, sendo a L. panamensis o principal agente etiológico dessas apresentações clínicas ^3,4.

A quimioterapia anti-leishmania existente que inclui drogas como antimoniais pentavalentes, miltefosina e anfotericina B é altamente tóxica e cara. Além disso, o aumento da resistência aos fármacos nas últimas décadas tem se somado aos fatores que interferem no tratamento efetivo dos pacientes em todo o^mundo5. Diferenças substanciais têm sido demonstradas entre as espécies do gênero Leishmania em relação à suscetibilidade a drogas, especialmente entre espécies do Novo e do Velho Mundo ^6,7. Por essas razões, é necessário direcionar esforços para a identificação e desenvolvimento de novas drogas anti-leishmania, com especial atenção às abordagens espécie-específicas. Estudar grandes bibliotecas de candidatos a fármacos com metodologias tradicionais é bastante difícil, uma vez que essas metodologias são muito trabalhosas para avaliar a atividade de compostos contra amastigotas intracelulares ou para realizar experimentos in vivo8; Portanto, tem sido necessário o desenvolvimento de novas técnicas que reduzam essas desvantagens, incluindo a implementação de genes repórteres e o desenvolvimento de ensaios de triagem fenotípica de alto conteúdo⁹.

O uso de genes repórteres mostrou o potencial de aumentar a eficiência do processo de triagem de drogas, pois facilita o desenvolvimento de ensaios de alto rendimento e in vivo. Parasitas recombinantes de Leishmania expressando vários genes repórteres têm sido gerados por vários grupos de pesquisa. Genes repórteres, como β-galactosidase, β-lactamase e luciferase, têm sido introduzidos em várias espécies de Leishmania utilizando vetores epissomais, mostrando utilidade limitada para triagem de drogas nas formas extra- e intracelulares do parasita10,11,12,13,14,15. Essas abordagens têm a limitação de exigir uma forte pressão seletiva em cultura para evitar a eliminação do construto epissomal, bem como o uso de reagentes adicionais para revelar a atividade do gene repórter. Por outro lado, a proteína fluorescente verde (GFP) e sua variante, a proteína fluorescente verde reforçada (eGFP), têm sido utilizadas na geração de um grande número de cepas transgênicas de Leishmania para ensaios de triagem in vitro de fármacos devido à sua flexibilidade e sensibilidade, bem como à possibilidade de automatizar o processo de triagem por citometria de fluxo ou fluorometria^{15, 16,17,18,19}. Apesar dos resultados promissores, as culturas dessas cepas transgênicas foram altamente heterogêneas em seus níveis de fluorescência, uma vez que o número de cópias do gene GFP não foi o mesmo em todos os parasitas. Além disso, a manutenção da fluorescência exigiu pressão seletiva constante sobre os parasitas em cultura, uma vez que o gene GFP foi introduzido em uma construção epissomal.

Pelas razões expostas anteriormente, muitos esforços têm se concentrado no desenvolvimento de novas metodologias para a produção de cepas recombinantes estáveis. Esses esforços têm se baseado principalmente na integração de genes repórteres em locos ribossomais, aproveitando as maiores taxas de transcrição de genes ribossomais²⁰. Cepas de L. infantum e L. amazonensis foram geradas integrando os genes que codificam para β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP²² e tdTomato²³, e foram avaliadas quanto à sua utilidade em ensaios de triagem de fármacos. Vários grupos desenvolveram cepas de L. donovani que expressam a GFP constitutivamente, integrando seu gene codificador ao locus do RNA ribossomal 18S (locus ssu) através de recombinação homóloga^24,25; apresentaram expressão estável e homogênea de GFP na população transfectada, incluindo amastigotas intracelulares 24,25, e foram implementadas com sucesso em ensaios de triagem de drogas^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 desenvolveram cepas de L. major e L. infantum expressando GFP como um transgene integrado. Eles utilizaram o vetor de integração pLEXSY, originalmente projetado para a expressão transgênica de proteínas em um sistema usando L. tarentolae como hospedeiro²⁸. O vetor pLEXSY-GFP tem se mostrado muito eficiente para a geração de diferentes cepas de Leishmania expressando constitutivamente GFP 24,25,27,29,30. Nesses parasitas, a fluorescência é homogênea e mantida nas formas intracelulares, podendo ser detectada em lesões de coxins plantares de camundongos^infectados27.

Neste trabalho, descrevemos a metodologia utilizada para gerar cepas de L. panamensis e L . donovani expressando o gene que codifica para eGFP como um transgene integrado usando o sistema pLEXSY. As cepas geradas por esse processo são utilizadas em nosso laboratório para a realização de ensaios de triagem de fármacos que avaliam a potencial atividade anti-leishmania de moléculas de origem natural e sintética.

Protocol

Para manter as amostras estéreis, todas as etapas que envolvem a cultura do parasito devem ser realizadas dentro de um capô de nível de biossegurança 2 (BSL-2) ou de acordo com as normas locais de saúde e segurança. Um resumo gráfico desse protocolo pode ser encontrado na Figura 1. Figura 1: Esquema resumo do protocolo para…

Representative Results

Depois de construir a construção pLEXSY-eGFP e transformar células de E. coli competentes, as colônias contendo a construção com a inserção de eGFP gerarão um produto de aproximadamente 859 pb após a execução da PCR de colônia descrita na seção 1.2 (Figura 3A). A digestão total do plasmídeo purificado das colônias positivas usando SwaI deve dar dois fragmentos característicos em eletroforese em gel, um fragmento de 2,9 kbp que é a porção do vetor PLEXS…

Discussion

As vantagens e desvantagens de vários genes repórteres têm sido estudadas em vários protozoários parasitas. Dentre elas, a GFP e a eGFP são intrinsecamente fluorescentes e permitem fácil quantificação e obtenção de imagens. A atividade fluorescente dessas proteínas pode ser detectada com manipulação mínima usando microscopia de fluorescência, fluorimetria ou citometria de fluxo. Poucos estudos foram realizados para gerar L expressando GFP. (Viannia), apesar da robustez demonstrada da GFP…

Materials

96 Well Microplates	Corning	CLS3340	Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid
Agarose	Sigma-Aldrich	A4718
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, suitable for cell culture
BglII restriction enzyme	New England BioLabs	R0144S	2,000 units. 10,000 units/mL
Cell Culture Flasks	Corning	CLS430168	Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Not available
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524
Gel Loading Buffer	Sigma-Aldrich	G2526	The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading.
Gene Pulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber.
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes	Bio-Rad	1652086	Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Inverted microscope	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF restriction enzyme	New England BioLabs	R3142S	4,000 units. 20,000 units/mL
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147	Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture.
LB Broth	Sigma-Aldrich	L2542	Liquid microbial growth medium
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1640300	Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence
pLEXSYcon2.1 expression kit	Jena Bioscience	EGE-1310sat	Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.
Potassium Chloride	Millipore	529552	Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures.
Schneider′s Insect Medium	Sigma-Aldrich	S0146	Medium used in our laboratory for culturing Leishmania.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration)
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzyme	New England BioLabs	R0604S	2,000 units. 10,000 units/mL
Syringe filters	Corning	CLS431212	regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends
Tris-Borate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA.