Развитие штаммов видов Leishmania с конститутивной экспрессией eGFP

Summary

В данной работе описывается методология получения штаммов L. panamensis и L . donovani , экспрессирующих ген eGFP в виде стабильного интегрированного трансгена с использованием системы pLEXSY. Трансфицированных паразитов клонировали путем предельного разведения, а клоны с самой высокой интенсивностью флуоресценции у обоих видов были отобраны для дальнейшего использования в скрининговых анализах на наркотики.

Abstract

Простейшие паразиты рода Leishmania вызывают лейшманиоз – заболевание с разнообразными клиническими проявлениями, которое поражает миллионы людей во всем мире. Инфекция, вызванная L. donovani, может привести к смертельному заболеванию висцеральных органов. В Панаме, Колумбии и Коста-Рике L. panamensis является причиной большинства зарегистрированных случаев кожного и кожно-кожного лейшманиоза. Изучение большого количества препаратов-кандидатов с помощью доступных на сегодняшний день методик является достаточно сложным, учитывая, что они очень трудоемки для оценки активности соединений в отношении внутриклеточных форм паразита или для проведения анализов in vivo . В данной работе описывается генерация штаммов L. panamensis и L. donovani с конститутивной экспрессией гена, кодирующего усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), интегрированный в локус, кодирующий 18S рРНК (ssu). Ген, кодирующий eGFP, был получен из коммерческого вектора и амплифицирован методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью его обогащения и добавления сайтов рестрикции для ферментов BglII и KpnI. Ампликон eGFP выделяли путем очистки агарозным гелем, расщепляли ферментами BglII и KpnI и лигировали в вектор экспрессии Leishmania pLEXSY-sat2.1, предварительно расщепленный тем же набором ферментов. Вектор экспрессии с клонированным геном размножали в кишечной палочке, очищали, а наличие вставки проверяли методом ПЦР колонии. Очищенную плазмиду линеаризировали и использовали для трансфекции паразитов L . donovani и L . panamensis. Интеграция гена была подтверждена методом ПЦР. Экспрессию гена eGFP оценивали методом проточной цитометрии. Флуоресцентных паразитов клонировали путем предельного разведения, а клоны с наибольшей интенсивностью флуоресценции отбирали с помощью проточной цитометрии.

Introduction

Простейшие паразиты рода Leishmania вызывают лейшманиоз – заболевание с широким спектром клинических проявлений. Это заболевание распространено в 98 странах, а его ежегодная заболеваемость оценивается в 0,9–1,6 миллиона^{случаев1}. Виды Leishmania, патогенные для человека, подразделяются на два подрода, а именно L. (Leishmania) и L. (Вянния). Заражение некоторыми видами, относящимися к L. Подроды (Leishmania), такие как L. donovani и L. infantum, могут приводить к висцеральному лейшманиозу (ВЛ), который приводит к летальному исходу, если его не лечить². Виды, принадлежащие к семейству L. Подрод (Viannia) ассоциирован с большинством случаев кожного лейшманиоза (КЛ) и слизисто-кожного лейшманиоза (МКЛ) в Центральной и Южной Америке, особенно в Панаме, Колумбии и Коста-Рике, причем L. panamensis является основным этиологическим агентом этих клинических проявлений ^3,4.

Существующая химиотерапия против лейшмании, которая включает такие препараты, как пятивалентные сурьмяны, милтефосин и амфотерицин В, является высокотоксичной и дорогостоящей. Кроме того, к факторам, препятствующим эффективному лечению^{пациентов во всем} мире, добавилась возросшая в последние десятилетия лекарственная устойчивость 5. Существенные различия были продемонстрированы между видами рода Leishmania в отношении восприимчивости к лекарственным препаратам, особенно между видами Нового и Старого Света ^6,7. По этим причинам необходимо направлять усилия на выявление и разработку новых препаратов против лейшмании, уделяя особое внимание видоспецифичным подходам. Изучение больших библиотек лекарственных препаратов-кандидатов с помощью традиционных методологий является достаточно сложным, учитывая, что эти методики очень трудоемки для оценки активности соединений в отношении внутриклеточных амастигот или для проведения экспериментов in vivo ⁸; В связи с этим возникла необходимость в разработке новых методов, позволяющих уменьшить эти недостатки, включая внедрение репортерных генов и разработку высокосодержательных фенотипических скрининговых тестов⁹.

Использование репортерных генов показало потенциал для повышения эффективности процесса скрининга лекарственных средств, поскольку это облегчает разработку высокопроизводительных анализов и анализов in vivo. Рекомбинантные паразиты Leishmania, экспрессирующие несколько репортерных генов, были созданы различными исследовательскими группами. Репортерные гены, такие как β-галактозидаза, β-лактамаза и люцифераза, были введены у нескольких видов Leishmania с использованием эписомальных векторов, что показало ограниченную полезность для скрининга лекарств во вне- и внутриклеточных формах паразита 10,11,12,13,14,15. Эти подходы имеют ограничение, заключающееся в том, что они требуют сильного селективного давления в культуре, чтобы избежать элиминации эписомальной конструкции, а также использования дополнительных реагентов для выявления активности репортерного гена. И наоборот, зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его вариант, усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), были использованы при генерации большого количества трансгенных штаммов лейшмании для скрининговых анализов на лекарственные препараты in vitro благодаря их гибкости и чувствительности, а также возможности автоматизации процесса скрининга с помощью проточной цитометрии или флуорометрии^{15. 16,17,18,19}. Несмотря на многообещающие результаты, культуры этих трансгенных штаммов были крайне неоднородны по уровню флуоресценции, поскольку количество копий гена GFP не было одинаковым у всех паразитов. Кроме того, поддержание флуоресценции требовало постоянного селективного давления на паразитов в культуре, поскольку ген GFP был введен в эписомальную конструкцию.

По причинам, изложенным выше, многие усилия были сосредоточены на разработке новых методологий получения стабильных рекомбинантных штаммов. Эти усилия в основном основывались на интеграции репортерных генов в рибосомные локусы, используя преимущества более высокой скорости транскрипции рибосомных генов²⁰. Штаммы L. infantum и L. amazonensis были получены с интеграцией генов, кодирующих β-галактоцидазу 21, IFP 1.4, iRFP²² и tdTomato²³, и они были оценены на предмет их полезности в скрининговых тестах на наркотики. В различных группах были выведены штаммы L. donovani, которые конститутивно экспрессируют GFP путем интеграции его кодирующего гена в локус 18S рибосомной РНК (локус ssu) посредством гомологичной рекомбинации^24,25; они показали стабильную и гомогенную экспрессию GFP в трансфицированной популяции, включая внутриклеточные амастиготы 24,25, и были успешно реализованы в скрининговых анализах на лекарственные препараты^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 разработали штаммы L. major и L. infantum, экспрессирующие GFP в виде интегрированного трансгена. Они использовали интеграционный вектор pLEXSY, первоначально разработанный для трансгенной экспрессии белков в системе, использующей L. tarentolae в качестве хозяина²⁸. Вектор pLEXSY-GFP показал себя очень эффективным для генерации различных штаммов Leishmania, конститутивно экспрессирующих GFP 24,25,27,29,30. У этих паразитов флуоресценция однородна и поддерживается во внутриклеточных формах, что может быть обнаружено в поражениях подушечек лап инфицированных мышей²⁷.

В данной работе описана методика получения штаммов L. panamensis и L . donovani , экспрессирующих ген, кодирующий eGFP, в виде интегрированного трансгена с использованием системы pLEXSY. Штаммы, полученные в результате этого процесса, используются в нашей лаборатории для проведения скрининговых анализов на наркотики, которые оценивают потенциальную антилейшманийную активность молекул природного и синтетического происхождения.

Protocol

Для поддержания стерильности образцов все этапы, связанные с культивированием паразитов, должны выполняться в колпаке уровня биобезопасности 2 (BSL-2) или в соответствии с местными правилами охраны труда и техники безопасности. Графическое описание этого протокола можно найти на <strong class…

Representative Results

После построения конструкции pLEXSY-eGFP и трансформации компетентных клеток E. coli колонии, содержащие конструкцию со вставкой eGFP, будут генерировать продукт примерно 859.н. после проведения ПЦР колоний, описанной в разделе 1.2 (рис. 3A). При полном расщеплении очищенной плаз…

Discussion

Преимущества и недостатки различных репортерных генов были изучены у нескольких простейших паразитов. Среди них GFP и eGFP по своей природе флуоресцентны и позволяют легко проводить количественную оценку и визуализацию. Флуоресцентная активность этих белков может быть обнаружена с мини…

Materials

96 Well Microplates	Corning	CLS3340	Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid
Agarose	Sigma-Aldrich	A4718
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, suitable for cell culture
BglII restriction enzyme	New England BioLabs	R0144S	2,000 units. 10,000 units/mL
Cell Culture Flasks	Corning	CLS430168	Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Not available
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524
Gel Loading Buffer	Sigma-Aldrich	G2526	The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading.
Gene Pulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber.
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes	Bio-Rad	1652086	Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Inverted microscope	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF restriction enzyme	New England BioLabs	R3142S	4,000 units. 20,000 units/mL
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147	Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture.
LB Broth	Sigma-Aldrich	L2542	Liquid microbial growth medium
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1640300	Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence
pLEXSYcon2.1 expression kit	Jena Bioscience	EGE-1310sat	Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.
Potassium Chloride	Millipore	529552	Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures.
Schneider′s Insect Medium	Sigma-Aldrich	S0146	Medium used in our laboratory for culturing Leishmania.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration)
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzyme	New England BioLabs	R0604S	2,000 units. 10,000 units/mL
Syringe filters	Corning	CLS431212	regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends
Tris-Borate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA.