Desarrollo de cepas de especies de Leishmania con expresión constitutiva de eGFP
Summary
En este trabajo se describe la metodología utilizada para generar cepas de L. panamensis y L . donovani que expresan el gen de eGFP como un transgén integrado estable utilizando el sistema pLEXSY. Los parásitos transfectados se clonaron limitando la dilución, y se seleccionaron los clones con la mayor intensidad de fluorescencia en ambas especies para su posterior uso en ensayos de detección de fármacos.
Abstract
Los parásitos protozoarios del género Leishmania causan leishmaniasis , una enfermedad con manifestaciones clínicas variables que afecta a millones de personas en todo el mundo. La infección por L. donovani puede provocar una enfermedad visceral mortal. En Panamá, Colombia y Costa Rica, L. panamensis es responsable de la mayoría de los casos reportados de leishmaniasis cutánea y mucocutánea. Estudiar un gran número de candidatos a fármacos con las metodologías disponibles hasta la fecha es bastante difícil, dado que son muy laboriosas para evaluar la actividad de compuestos frente a formas intracelulares del parásito o para realizar ensayos in vivo . En este trabajo, describimos la generación de cepas de L. panamensis y L. donovani con expresión constitutiva del gen que codifica para una proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) integrada en el locus que codifica para el ARNr 18S (ssu). El gen que codifica eGFP se obtuvo de un vector comercial y se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para enriquecerlo y agregar sitios de restricción para las enzimas BglII y KpnI. El amplicón de eGFP se aisló mediante purificación en gel de agarosa, se digirió con las enzimas BglII y KpnI, y se ligó en el vector de expresión de Leishmania pLEXSY-sat2.1 previamente digerido con el mismo conjunto de enzimas. El vector de expresión con el gen clonado se propagó en E. coli, se purificó y se verificó la presencia del inserto mediante PCR de colonias. El plásmido purificado fue linealizado y utilizado para transfectar parásitos L. donovani y L . panamensis. La integración del gen se verificó mediante PCR. La expresión del gen eGFP se evaluó mediante citometría de flujo. Los parásitos fluorescentes se clonaron mediante dilución limitante, y los clones con la mayor intensidad de fluorescencia se seleccionaron mediante citometría de flujo.
Introduction
Los parásitos protozoarios del género Leishmania causan leishmaniasis, una enfermedad con una amplia gama de manifestaciones clínicas. Esta enfermedad es prevalente en 98 países y su incidencia anual se estima entre 0,9 y 1,6 millones de casos1. Las especies de Leishmania que son patógenas para los humanos se dividen en dos subgéneros, a saber, L. (Leishmania) y L. (Viannia). Infección con algunas especies pertenecientes a la L. Los subgéneros (Leishmania), como L. donovani y L. infantum, pueden provocar leishmaniasis visceral (LV), que es mortal sino se trata. Especies pertenecientes a la L. (Viannia) se asocian con la mayoría de los casos de leishmaniasis cutánea (LC) y leishmaniasis mucocutánea (LCM) en América Central y del Sur, particularmente en Panamá, Colombia y Costa Rica, siendo L. panamensis el principal agente etiológico de estas presentaciones clínicas 3,4.
La quimioterapia antileishmania existente, que incluye fármacos como los antimoniales pentavalentes, la miltefosina y la anfotericina B, es muy tóxica y costosa. Además, el aumento de la resistencia a los medicamentos durante las últimas décadas se ha sumado a los factores que interfieren con el tratamiento efectivo de los pacientes en todo el mundo5. Se han demostrado diferencias sustanciales entre las especies del género Leishmania en relación con la susceptibilidad a los medicamentos, especialmente entre las especies del Nuevo y el Viejo Mundo 6,7. Por estas razones, es necesario dirigir los esfuerzos a la identificación y desarrollo de nuevos fármacos contra la leishmania, prestando especial atención a los enfoques específicos de cada especie. El estudio de grandes bibliotecas de candidatos a fármacos con metodologías tradicionales es bastante difícil, dado que estas metodologías son muy laboriosas para evaluar la actividad de compuestos frente a amastigotes intracelulares o para realizar experimentos in vivo 8; Por lo tanto, ha sido necesario desarrollar nuevas técnicas que reduzcan estas desventajas, incluyendo la implementación de genes reporteros y el desarrollo de ensayos de cribado fenotípico de alto contenido9.
El uso de genes reporteros ha demostrado el potencial para aumentar la eficiencia del proceso de cribado de fármacos, ya que facilita el desarrollo de ensayos de alto rendimiento e in vivo. Varios grupos de investigación han generado parásitos recombinantes de Leishmania que expresan varios genes reporteros. Los genes reporteros, como la β-galactosidasa, la β-lactamasa y la luciferasa, se han introducido en varias especies de Leishmania utilizando vectores episomales, mostrando una utilidad limitada para el cribado de fármacos en formas extracelulares e intracelulares del parásito 10,11,12,13,14,15. Estos enfoques tienen la limitación de requerir una fuerte presión selectiva en cultivo para evitar la eliminación de la construcción episomal, así como el uso de reactivos adicionales para revelar la actividad del gen reportero. Por el contrario, la proteína verde fluorescente (GFP) y su variante, la proteína verde fluorescente mejorada (eGFP), se han utilizado en la generación de un gran número de cepas transgénicas de Leishmania para ensayos de cribado de fármacos in vitro debido a su flexibilidad y sensibilidad, así como a la posibilidad de automatizar el proceso de cribado mediante citometría de flujo o fluorometría15. 16,17,18,19. A pesar de los resultados prometedores, los cultivos de estas cepas transgénicas fueron muy heterogéneos en sus niveles de fluorescencia, ya que el número de copias del gen GFP no fue el mismo en todos los parásitos. Además, el mantenimiento de la fluorescencia requirió una presión selectiva constante sobre los parásitos en cultivo, ya que el gen GFP se introdujo en una construcción episomal.
Por las razones antes expuestas, muchos esfuerzos se han centrado en el desarrollo de nuevas metodologías para la producción de cepas recombinantes estables. Estos esfuerzos se han basado principalmente en la integración de genes reporteros en loci ribosómicos, aprovechando las mayores tasas de transcripción de los genes ribosómicos20. Se han generado cepas de L. infantum y L. amazonensis que han integrado los genes que codifican para la β-galactocidasa 21, IFP 1.4, iRFP 22 y tdTomato 23, y se ha evaluado su utilidad en ensayos de cribado de fármacos. Varios grupos han desarrollado cepas de L. donovani que expresan GFP de forma constitutiva mediante la integración de su gen codificante en el locus de ARN ribosómico 18S (locus ssu) a través de la recombinación homóloga24,25; mostraron una expresión estable y homogénea de GFP en la población transfectada, incluyendo amastigotes intracelulares 24,25, y se implementaron con éxito en ensayos de cribado de fármacos24,25,26. Bolhassani et al.27 desarrollaron cepas de L. major y L. infantum que expresan GFP como un transgén integrado. Utilizaron el vector de integración pLEXSY, diseñado originalmente para la expresión transgénica de proteínas en un sistema que utilizaba L. tarentolae como huésped28. El vector pLEXSY-GFP ha demostrado ser muy eficiente para la generación de diferentes cepas de Leishmania que expresan constitutivamente GFP 24,25,27,29,30. En estos parásitos, la fluorescencia es homogénea y se mantiene en las formas intracelulares, pudiendo detectarse en las lesiones de las almohadillas de los pies de ratones infectados27.
En este trabajo se describe la metodología utilizada para la generación de cepas de L. panamensis y L . donovani que expresan el gen que codifica para eGFP como un transgén integrado utilizando el sistema pLEXSY. Las cepas generadas a través de este proceso se utilizan en nuestro laboratorio para la realización de ensayos de cribado de fármacos que evalúan la potencial actividad anti-leishmania de moléculas de origen natural y sintético.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se han estudiado las ventajas y desventajas de varios genes reporteros en varios parásitos protozoarios. Entre ellos, GFP y eGFP son intrínsecamente fluorescentes y permiten una fácil cuantificación e imagen. La actividad fluorescente de estas proteínas se puede detectar con una manipulación mínima mediante microscopía de fluorescencia, fluorimetría o citometría de flujo. Se han realizado pocos estudios para generar L que exprese GFP. (Viannia), a pesar de la robustez demostrada de GFP y sus d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, número de subvención NI-177-2016, y Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, subvención números SNI-169-2018, SNI-008-2022 y SNI-060-2022.
Materials
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
Referências
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).
- Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243 (2020).
- Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
- Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266 (2016).
- Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
- Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
- Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
- Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
- Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
- Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
- Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
- Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
- Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
- Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).
- García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).
- Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
- De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771 (2015).
- Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
- Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
- Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
- Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
- Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , (2012).
- Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
- Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
- Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).
- Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
- Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).
