Sviluppo di ceppi di specie di Leishmania con espressione costitutiva di eGFP

Summary

Qui, descriviamo la metodologia utilizzata per generare ceppi di L. panamensis e L . donovani che esprimono il gene per eGFP come transgene integrato stabile utilizzando il sistema pLEXSY. I parassiti trasfettati sono stati clonati limitando la diluizione e i cloni con la più alta intensità di fluorescenza in entrambe le specie sono stati selezionati per un ulteriore utilizzo nei saggi di screening farmacologico.

Abstract

I parassiti protozoari del genere Leishmania causano la leishmaniosi , una malattia con manifestazioni cliniche variabili che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. L’infezione da L. donovani può provocare una malattia viscerale fatale. A Panama, Colombia e Costa Rica, L. panamensis è responsabile della maggior parte dei casi segnalati di leishmaniosi cutanea e mucocutanea. Studiare un gran numero di farmaci candidati con le metodologie disponibili fino ad oggi è abbastanza difficile, dato che sono molto laboriosi per valutare l’attività dei composti contro le forme intracellulari del parassita o per eseguire saggi in vivo . In questo lavoro, descriviamo la generazione di ceppi di L. panamensis e L. donovani con espressione costitutiva del gene che codifica per una proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) integrata nel locus che codifica per l’rRNA 18S (ssu). Il gene che codifica per l’eGFP è stato ottenuto da un vettore commerciale e amplificato dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) per arricchirlo e aggiungere siti di restrizione per gli enzimi BglII e KpnI. L’amplicone eGFP è stato isolato mediante purificazione su gel di agarosio, digerito con gli enzimi BglII e KpnI, e legato nel vettore di espressione di Leishmania pLEXSY-sat2.1 precedentemente digerito con lo stesso set di enzimi. Il vettore di espressione con il gene clonato è stato propagato in E. coli, purificato, e la presenza dell’inserto è stata verificata mediante colony PCR. Il plasmide purificato è stato linearizzato e utilizzato per trasfettare i parassiti di L. donovani e L . panamensis. L’integrazione del gene è stata verificata mediante PCR. L’espressione del gene eGFP è stata valutata mediante citometria a flusso. I parassiti fluorescenti sono stati clonati limitando la diluizione e i cloni con la più alta intensità di fluorescenza sono stati selezionati utilizzando la citometria a flusso.

Introduction

I parassiti protozoari del genere Leishmania causano la leishmaniosi, una malattia con una vasta gamma di manifestazioni cliniche. Questa malattia è prevalente in 98 paesi e la sua incidenza annuale è stimata tra 0,9 e 1,6 milioni di casi¹. Le specie di Leishmania che sono patogene per l’uomo sono divise in due sottogeneri, vale a dire L. (Leishmania) e L. (Viannia). Infezione con alcune specie appartenenti alla L. (Leishmania) sottogenere, come L. donovani e L. infantum, può provocare leishmaniosi viscerale (VL), che è fatale se non trattata². Specie appartenenti alla L. (Viannia) sono associati alla maggior parte dei casi di leishmaniosi cutanea (CL) e leishmaniosi mucocutanea (MCL) in America centrale e meridionale, in particolare a Panama, Colombia e Costa Rica, con L. panamensis che è il principale agente eziologico di queste presentazioni cliniche ^3,4.

La chemioterapia anti-leishmania esistente che include farmaci come antimoniali pentavalenti, miltefosina e amfotericina B è altamente tossica e costosa. Inoltre, l’aumento della resistenza ai farmaci negli ultimi decenni è stato aggiunto ai fattori che interferiscono con il trattamento efficace dei pazienti in tutto il mondo⁵. Differenze sostanziali sono state dimostrate tra le specie del genere Leishmania in relazione alla suscettibilità ai farmaci, in particolare tra le specie del Nuovo e del Vecchio Mondo ^6,7. Per questi motivi, è necessario indirizzare gli sforzi verso l’identificazione e lo sviluppo di nuovi farmaci anti-leishmania, prestando particolare attenzione agli approcci specie-specifici. Studiare grandi librerie di farmaci candidati con metodologie tradizionali è abbastanza difficile, dato che queste metodologie sono molto laboriose per valutare l’attività di composti contro amastigoti intracellulari o per eseguire esperimenti in vivo ⁸; Pertanto, è stato necessario sviluppare nuove tecniche che riducano questi svantaggi, compresa l’implementazione di geni reporter e lo sviluppo di saggi di screening fenotipico ad alto contenuto⁹.

L’uso di geni reporter ha dimostrato il potenziale per aumentare l’efficienza del processo di screening dei farmaci in quanto facilita lo sviluppo di saggi ad alto rendimento e in vivo. I parassiti ricombinanti della Leishmania che esprimono diversi geni reporter sono stati generati da vari gruppi di ricerca. I geni reporter, come la β-galattosidasi, la β-lattamasi e la luciferasi, sono stati introdotti in diverse specie di Leishmania utilizzando vettori episomiali, mostrando un’utilità limitata per lo screening dei farmaci nelle forme extra- e intracellulari del parassita 10,11,12,13,14,15. Questi approcci hanno il limite di richiedere una forte pressione selettiva in coltura per evitare l’eliminazione del costrutto episomiale, nonché l’uso di reagenti aggiuntivi per rivelare l’attività del gene reporter. Al contrario, la proteina fluorescente verde (GFP) e la sua variante, la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), sono state utilizzate nella generazione di un gran numero di ceppi transgenici di Leishmania per saggi di screening farmacologico in vitro grazie alla loro flessibilità e sensibilità, nonché alla possibilità di automatizzare il processo di screening utilizzando citometria a flusso o fluorometria^{15, 16,17,18,19}. Nonostante i risultati promettenti, le colture di questi ceppi transgenici erano altamente eterogenee nei loro livelli di fluorescenza, poiché il numero di copie del gene GFP non era lo stesso in tutti i parassiti. Inoltre, il mantenimento della fluorescenza richiedeva una pressione selettiva costante sui parassiti in coltura, poiché il gene GFP è stato introdotto in un costrutto episomiale.

Per le ragioni esposte in precedenza, molti sforzi si sono concentrati sullo sviluppo di nuove metodologie per la produzione di ceppi ricombinanti stabili. Questi sforzi si sono basati principalmente sull’integrazione dei geni reporter nei loci ribosomiali, sfruttando i più alti tassi di trascrizione dei geni ribosomiali²⁰. I ceppi di L. infantum e L. amazonensis sono stati generati dopo aver integrato i geni che codificano per β-galattocidasi 21, IFP 1.4, iRFP 22 e tdTomato²³, e sono stati valutati per la loro utilità nei saggi di screening dei farmaci. Vari gruppi hanno sviluppato ceppi di L. donovani che esprimono la GFP costitutivamente integrando il suo gene codificante nel locus dell’RNA ribosomiale 18S (locus ssu) attraverso la ricombinazione omologa^24,25; hanno mostrato un’espressione stabile e omogenea di GFP nella popolazione trasfettata, inclusi amastigoti intracellulari 24,25, e sono stati implementati con successo nei saggi di screening dei farmaci^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 hanno sviluppato ceppi di L. major e L. infantum che esprimono GFP come transgene integrato. Hanno usato il vettore di integrazione pLEXSY, originariamente progettato per l’espressione transgenica di proteine in un sistema che utilizza L. tarentolae come ospite²⁸. Il vettore pLEXSY-GFP ha dimostrato di essere molto efficiente per la generazione di diversi ceppi di Leishmania che esprimono costitutivamente GFP 24,25,27,29,30. In questi parassiti, la fluorescenza è omogenea e mantenuta nelle forme intracellulari, potendo essere rilevata nelle lesioni del cuscinetto dei topi infetti²⁷.

In questo lavoro, descriviamo la metodologia utilizzata per generare ceppi di L. panamensis e L . donovani che esprimono il gene che codifica per eGFP come transgene integrato utilizzando il sistema pLEXSY. I ceppi generati attraverso questo processo sono utilizzati nel nostro laboratorio per eseguire saggi di screening farmacologico che valutano la potenziale attività anti-leishmania di molecole di origine naturale e sintetica.

Protocol

Per mantenere i campioni sterili, tutte le fasi che coinvolgono la coltura parassitaria devono essere eseguite all’interno di una cappa di livello di biosicurezza 2 (BSL-2) o secondo le normative locali in materia di salute e sicurezza. Un riepilogo grafico di questo protocollo è disponibile nella Figura 1. Figura 1: Schema riass…

Representative Results

Dopo aver costruito il costrutto pLEXSY-eGFP e trasformato cellule di E. coli competenti, le colonie contenenti il costrutto con l’inserto eGFP genereranno un prodotto di circa 859 bp dopo aver eseguito la PCR di colonia descritta nella sezione 1.2 (Figura 3A). La digestione totale del plasmide purificato da colonie positive utilizzando SwaI dovrebbe dare due frammenti caratteristici in elettroforesi su gel, un frammento di 2,9 kbp che è la porzione del vettore PLEXSY cont…

Discussion

I vantaggi e gli svantaggi di vari geni reporter sono stati studiati in diversi protozoi parassiti. Tra questi, GFP ed eGFP sono intrinsecamente fluorescenti e consentono una facile quantificazione e imaging. L’attività fluorescente di queste proteine può essere rilevata con una manipolazione minima utilizzando microscopia a fluorescenza, fluorimetria o citometria a flusso. Pochi studi sono stati condotti per generare L che esprime GFP. (Viannia), nonostante la dimostrata robustezza della GFP e dei lo…

Materials

96 Well Microplates	Corning	CLS3340	Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid
Agarose	Sigma-Aldrich	A4718
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, suitable for cell culture
BglII restriction enzyme	New England BioLabs	R0144S	2,000 units. 10,000 units/mL
Cell Culture Flasks	Corning	CLS430168	Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Not available
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524
Gel Loading Buffer	Sigma-Aldrich	G2526	The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading.
Gene Pulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber.
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes	Bio-Rad	1652086	Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Inverted microscope	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF restriction enzyme	New England BioLabs	R3142S	4,000 units. 20,000 units/mL
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147	Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture.
LB Broth	Sigma-Aldrich	L2542	Liquid microbial growth medium
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1640300	Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence
pLEXSYcon2.1 expression kit	Jena Bioscience	EGE-1310sat	Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.
Potassium Chloride	Millipore	529552	Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures.
Schneider′s Insect Medium	Sigma-Aldrich	S0146	Medium used in our laboratory for culturing Leishmania.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration)
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzyme	New England BioLabs	R0604S	2,000 units. 10,000 units/mL
Syringe filters	Corning	CLS431212	regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends
Tris-Borate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA.