Denne protokol gør det muligt at afsløre virkningen af profager på deres værter. Bakteriekulturer synkroniseres ved hjælp af betingelser, der bedst understøtter den lysogene tilstand, hvilket begrænser spontan induktion. RT-qPCR skelner entydigt mellem prophagebegrænsede gener og dem, der er afkoblet fra fagkontrol, fra dem, der udtrykkes under den lytiske replikationscyklus.
Tempererede fager findes integreret som fager i de fleste bakterielle genomer. Nogle profager er kryptiske og fikserede i bakteriekromosomet, men andre er aktive og kan udløses i en replikativ form enten spontant eller ved eksponering for inducerende faktorer. Fager er almindeligvis forbundet med evnen til at give toksinproduktion eller andre virulensassocierede træk på deres værtscelle. Nyere undersøgelser har vist, at de kan spille en meget større rolle i at ændre deres værters fysiologi. Den her beskrevne teknik har gjort os i stand til at undersøge, hvordan fager påvirker genekspression i den opportunistiske bakterie Pseudomonas aeruginosa.
I dette arbejde blev væksten af vildtypen P. aeruginosa-stammen PAO1 sammenlignet med væksten af isogene lysogener, der bærer forskellige kombinationer af profager fra Liverpool Epidemic Strain (LES) LESB58. I en lysogenkultur vil en andel af bakterieceller understøtte lytisk bakteriofagreplikation (spontan induktion) med et højt ekspressionsniveau pr. celle af sene faggener, såsom dem, der er forbundet med samling af fagpartikler, hvilket maskerer genekspressionen på lavt niveau forbundet med lysogenbegrænset genekspression. Virkningen af spontan induktion kan således skjule profaggenekspression på tværs af en lysogenpopulation.
Vækstprofileringseksperimenter blev brugt til at identificere spontan induktion, som var minimal i den tidlige eksponentielle vækstfase. Denne undersøgelse rapporterer, hvordan man forbereder prøvekulturer i den tidlige eksponentielle vækstfase, og hvordan man opretter passende kontroller på trods af lave celletal. Disse protokoller sikrer pålidelig og reproducerbar sammenligning af vildtype- og lysogene bakterier under forskellige forhold, hvilket forbedrer den transkriptomiske profilering af profaggenomer og hjælper med at identificere tidligere ukendte profagfunktioner.
For nylig har fagterapi til bekæmpelse af antimikrobiel resistens1 og CRISPR-Cas-baseret genredigering2 skabt fornyet interesse for bakteriofagforskning. Igen har fremskridt inden for bioteknologi muliggjort en dybere undersøgelse af interaktionerne mellem bakterier og fager3. Den terapeutiske anvendelse af (“fagterapi”) hæmmes imidlertid af bekymringer om fager, der fungerer som mobile genetiske elementer med evnen til at overføre virulens og resistensgener vandret4. Udvidelsen af “mørkt stof”5 (gener med ukendte funktioner) er både foruroligende og lokkende. Mørkt stof betragtes som et hul i vores forståelse af fagbiologi og en stort set uudnyttet ressource til molekylære værktøjer og potentielle nye behandlinger6. Udviklingen af high-throughput sekventeringsteknikker sammen med forbedret genannotation 7,8,9 og nye peptidfoldningsalgoritmer10 forbedrer detektion, beskrivelse og funktionel forudsigelse af faggener. Videnskaben er dog stadig langt fra at validere de fleste fagers genfunktioner i kultur eller i den virkelige verden.
RNA-sekventering (RNA-Seq) kan globalt kortlægge genekspression under faginfektion og har signifikant forbedret forståelsen af både- og bakterieelementer, der er involveret i lytiske og lysogene cyklusser11,12. Under lysogene processer integreres tempererede faggenomer i bakterielt DNA for at blive profager13. Globale genekspressionsprofileringseksperimenter kan bruges til at identificere prophagebegrænsede gener, der er kodet på tempererede faggenomer, men kun udtrykt under den lysogene tilstand11. Sådanne gener koder ikke for fagstrukturelle proteiner og er ikke involveret i nogen faginfektionsprocesser. RNA-Seq kan bruges til at identificere de gener, der er mere tilbøjelige til at påvirke bakterieværtens biologi, enten ved at inducere en gevinst af funktion eller regulere de eksisterende bakteriegener, hvilket ofte gør det muligt for bakterierne at tilpasse sig skiftende miljøer. Derfor kunne profagernes evne til at fungere som mikrobielle marionetmestre, der styrer en række bakteriefunktioner, undersøges.
Der er to store barrierer for effektiv analyse af prophage-begrænset genekspression. For det første er tilgængeligheden af modtagelige værter et centralt spørgsmål. Per definition er profager allerede inkorporeret i deres specifikke værtsgenom, så det er udfordrende at finde en modtagelig vildtypevært til at sammenligne den globale genekspression i tilstedeværelsen og fraværet af prophagen. Dette kan opnås enten gennem de novo-infektion af en anden modtagelig vært eller sletning af profagen fra det oprindelige vildtypeisolat uden at forstyrre resten af værtsgenomet. Den anden barriere ligger i den heterogene karakter af lysogene populationer. Nogle profager nedbrydes gennem mutation eller rekombination for at blive “kryptiske”, hvilket betyder, at de er fastgjort på et bestemt sted i bakteriegenomet. Imidlertid er andre profager “aktive” og kan induceres i en replikativ, lytisk cyklus spontant eller efter eksponering for inducerende faktorer. I mange lysogene kulturer betyder hastigheden af spontan induktion, at en del af bakteriecellerne altid gennemgår lytisk fagreplikation14,15,16. Et højt ekspressionsniveau af sene faggener i disse populationer maskerer genekspressionen på lavt niveau forbundet med lysogenbegrænset genekspression11,17. Andelen af lysogener, der gennemgår spontan profaginduktion, kan variere med væksttilstanden, vækstbetingelserne eller andre udløsere. For at studere virkningerne af profager på lysogenet skal spontane profaginduktionshændelser minimeres så meget som muligt ved at optimere vækstbetingelserne for at favorisere den lysogene tilstand.
Denne undersøgelse rapporterer det forberedende arbejde, der er udført for at undersøge indflydelsen fra et sæt samlevende profager fra Liverpool Epidemic Strain (LES) af Pseudomonas aeruginosa. Aktive profager blev induceret og isoleret fra LES og anvendt til at inficere modellen P. aeruginosa-værtsstammen, PAO116,18,19. Hele genomerne af vildtypen P. aeruginosa-stammen, PAO1, og dens lysogen, PAO1Φ2, blev sekventeret (i en dybde på 30x dækning) for at sikre identiteten af vildtypestammen og for at bekræfte, at lysogen var isogen. LES har været forbundet med øget sygelighed og dødelighed hos patienter med cystisk fibrose, og LES-fager 19 er blevet foreslået at hjælpe tilpasning til lungemiljøet for cystisk fibrose16,19,20. På trods af stærke beviser for, at disse fager påvirker biologien hos deres vært20,21, er størstedelen af deres genfunktioner endnu ikke karakteriseret, og de specifikke interaktionsmekanismer er dårligt forstået. En transkriptomisk tilgang kan empirisk afdække profaggenets funktioner i en kontrolleret værtsbaggrund. Da spontan induktion kan påvirke ekspressionsprofiler, beskriver denne artikel, hvordan man optimerer vækstbetingelserne for at favorisere den lysogene tilstand. En sådan synkronisering af kulturer kan valideres ved PCR i realtid for at kvantificere ekspressionsniveauerne for vigtige genetiske markører, der er forbundet med afgørende stadier af LES-fagreplikation i PAO1. Den samme tilgang er tidligere blevet brugt til at identificere de prophagebegrænsede funktioner af shiga-toksigeniske fager, der påvirker motilitet, syreresistens og antimikrobiel resistens i Escherichia coli11,17,21,22.
Oprettelsen af en selekterbar indikatorvært, der tidligere blev brugt i plakassays for mere nøjagtigt at kvantificere den spontane induktion af Stx-fra E. coli MC106137,38,39, er beskrevet her for P. aeruginosa- LESΦ2. Denne intervention har den ekstra fordel, at den reducerer prøvebehandlingstrinnene og -tiden, hvilket muliggør samtidig vurdering af spontane induktionshastigheder under flere dyrkningsforhold. Der er risiko for at generere andre mutationer under dannelsen af rifampicinresistente varianter40; I dette arbejde blev den udviklede stamme imidlertid kun brugt som indikatorvært til optælling af plaques fra kulturer af interesse og blev ikke inkluderet i den transkriptomiske analyse. Så længe den valgbare indikatorstamme forbliver lige så modtagelig for infektion af fagen af interesse, er der ingen bekymring for andre erhvervede mutationer. Ikke desto mindre blev der ikke påvist forskelle i polymorfiprofilerne for restriktionsfragmentlængde ved pulsfeltgelelektroforese (PFGE) analyse af PAO1WT og PAO1RIF (data ikke vist).
Når man vælger værtsceller, er det sjældent at finde en indikatorstamme, der ikke allerede har prophager. Som et eksempel har PAO1 den trådformede prophage Pf4. De eksperimentelle kontroller til denne undersøgelse var designet til direkte at kunne undersøge genekspressionen af specifikke fager (i dette tilfælde LES-profag 2) og de virkninger, denne har på bakteriel genekspression. I sammenligningen af transkripter fra PAO1, der bærer LES-profagen 2 og mangler LES-prophage 2 (både lysogen og ikke-lysogen bærer den endogene Pf4), som tjener som interne kontroller for at udelukke virkningen af Pf4 på værten. Derudover er det blevet påvist, at Pf4 normalt ikke forårsager lysis i sin værtscelle41 og derfor ikke er i stand til at forvirre resultaterne af disse eksperimenter.
Det er veletableret, at omhyggelig kvalitetskontrol er afgørende for prøveforberedelsen med henblik på at producere meningsfulde omics-data42. Som tidligere beskrevet11 udføres imidlertid sjældent den omhyggelige karakterisering af profagaktivitet ved fremstilling af lysogenkulturer til sådanne undersøgelser. Her beskriver vi vores systematiske protokoller til forberedelse af et velkontrolleret og optimeret sæt kulturer til transkriptomiske undersøgelser for bedre at udforske interaktionerne mellem bakterier og tempererede fager. Befolkningens synkronicitet blev kontrolleret ved at bringe kulturen gennem mindst fire fordoblinger, før den blev behandlet med det inducerende antibiotikum norfloxacin. Ved at bestemme MIC for norfloxacin for stammen i undersøgelsen kunne vi sikre, at koncentrationen af det inducerende middel var lige over MIC til “induktionsbehandlingen”. De behandlede celler blev derefter fortyndet 1:10 for at sænke norfloxacinkoncentrationen under MIC efter 1 times behandling for at give cellerne mulighed for at komme sig og fuldføre fagreplikationsprocessen, der sluttede i lysering af cellen og frigivelse af infektiøst fagafkom. Cellerne går først ind i den lytiske replikationscyklus efter induktionsstimulus, når koncentrationen af norfloxacin er bragt under MIC i restitutionsperioden. I dette tilfælde betyder overskridelse af 1 μg·ml-1 norfloxacin, at lægemidlet ikke effektivt kunne fortyndes under MIC, da MIC for norfloxacin for PAO1 er 0,19 μg·ml-1. Niveauet af inducerfortynding skal afbalanceres med behovet for lysogengenvinding og tilbageholdelse af kulturtætheden til høst af RNA. De data, der diskuteres her, viser, at det er muligt at synkronisere kulturer for at skabe prøver, hvor lysogeni dominerer, hvilket reducerer støj fra spontan induktion og muliggør påvisning af ægte lysogeni-drevne ændringer i genekspression. Da den lysogene tilstand er fremherskende i den tidlige eksponentielle vækstfase, når bakteriecelletætheden er lav, foreslår vi at opskalere kulturerne for at høste nok RNA til efterfølgende genekspressionsundersøgelser som RNA-Seq.
Anvendelsen af norfloxacin som inducerende middel til at tvinge kulturer ind i den lytiske cyklus er velrapporteret43,44; Dette vil dog også påvirke ekspressionen af andre bakteriegener i processen45,46. For at afbøde dette bør RNA-biblioteker fra kontrolvildtypekulturer, der dyrkes under de samme inducerende og ikke-inducerende betingelser, inkluderes i RNA-Seq-eksperimenter. Brugen af interne kontroller og nøglemarkørgener til at validere stadierne af fagreplikation ved qRT-PCR er også afgørende for nøjagtige sammenligninger. Kvantitativ RT-PCR-profilering kan ikke fortolkes ved at sammenligne det absolutte antal transkripter for hvert gen på forskellige tidspunkter; Det er profilens form, der betyder noget. For det første er kun en lille region i transkriptet for ethvert gen blevet samplet, så om det er et kortvarigt eller længerelivet element er ukendt27. RNA-Seq-kortlægning af transkripter viser bestemt, at tætheden af kortlægningsdataene varierer betydeligt over længden af et gen. For det andet er det formen på genekspressionsprofilen, der skal fortolkes for et markørgen, der er forbundet med den lytiske cyklus eller den lysogene livsstil eller endda afkoblet fra fagreguleringskredsløbene11. Spontan induktion er et reelt problem i lysogenkulturen og vil altid resultere i ekspression af lytiske cyklusassocierede gener. Profilering viser imidlertid, at de gener, der er forbundet med den lytiske replikationscyklus, undertrykkes i deres ekspression før induktion (mindst to logfolder) og opreguleret efter induktion.
De tidligere udførte transkriptomiske analyser af Stx-faginteraktioner med E. coli understøtter en grundig forståelse af de faggener, der er involveret i at opretholde lysogeni og udløse den lytiske cyklus11,17. I øjeblikket er LES-fagerne af P. aeruginosa blevet kommenteret, men deres vigtigste genfunktioner forstås mindre godt. Transkriptomiske undersøgelser vil muliggøre genannotering af LES-profagerne og forbedre vores forståelse af de gener, der er involveret i lysogeni og lytisk cyklus. At forbinde gensekvens med funktion udgør en stor udfordring i studiet af nye former, hvilket yderligere understreger behovet for flere undersøgelser for at bekræfte faggenets funktioner til produktion af bedre annotationsværktøjer47. Den bredere anvendelse og tilpasning af protokollerne og ekstra kvalitetskontrolforanstaltninger, der er beskrevet i denne videoartikel, kan hjælpe med at afsløre forskellige profagfunktioner og dermed forbedre annotationsrørledninger og transformere vores forståelse af og bakteriebiologi.
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |