TACI: En ImageJ Plugin til 3D Calcium Imaging Analyse
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) er et open source ImageJ-plugin til 3D-calciumbilledanalyse, der undersøger bevægelse på z-aksen og identificerer den maksimale værdi af hver z-stak for at repræsentere en celles intensitet på det tilsvarende tidspunkt. Det kan adskille neuroner, der overlapper hinanden i lateral (x / y) retning, men på forskellige z-planer.
Abstract
Forskning i neurovidenskab har udviklet sig til at bruge komplekse billeddannelses- og beregningsværktøjer til at udtrække omfattende information fra datasæt. Calciumbilleddannelse er en meget anvendt teknik, der kræver sofistikeret software for at opnå pålidelige resultater, men mange laboratorier kæmper for at vedtage beregningsmetoder, når de opdaterer protokoller for at opfylde moderne standarder. Vanskeligheder opstår på grund af manglende programmeringskendskab og betalingsmure til software. Derudover viser celler af interesse bevægelser i alle retninger under calciumbilleddannelse. Mange tilgange er blevet udviklet til at korrigere bevægelsen i lateral (x / y) retning.
Dette papir beskriver en arbejdsgang ved hjælp af et nyt ImageJ-plugin, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), til at undersøge bevægelse på z-aksen i 3D-calciumbilleddannelse. Denne software identificerer den maksimale fluorescensværdi fra alle de z-positioner, en neuron vises i, og bruger den til at repræsentere neuronens intensitet ved den tilsvarende t-position. Derfor kan dette værktøj adskille neuroner, der overlapper hinanden i lateral (x / y) retning, men vises på forskellige z-planer. Som et ImageJ-plugin er TACI et brugervenligt, open source-beregningsværktøj til 3D-calciumbilledanalyse. Vi validerede denne arbejdsgang ved hjælp af fluelarvens termofølsomme neuroner, der viste bevægelser i alle retninger under temperaturudsving og et 3D-calciumbilleddannelsesdatasæt erhvervet fra fluehjernen.
Introduction
Niveauet af intracellulært calcium er en præcis markør for neuronal excitabilitet. Calciumbilleddannelse måler ændringerne i intracellulært calcium for at forstå neuronal aktivitet1. Undersøgelser inden for neurovidenskab har i stigende grad brugt denne metode på grund af udviklingen af teknikker til måling af intracellulær calciumkoncentration, herunder genetisk kodede calciumindikatorer (GECI’er), såsom GCaMP2,3, som kan udtrykkes ikke-invasivt i specifikke sæt neuroner gennem genetiske tilgange. De lavere omkostninger til lasere og mikroskopkomponenter har også øget brugen af calciumbilleddannelse4. Det er vigtigt, at calciumbilleddannelse giver mulighed for registrering og undersøgelse af enkelte neuroner såvel som store neuronpopulationer samtidigt i frit bevægelige dyr5.
Ikke desto mindre er analysen af calciumbilleddannelsesdata udfordrende, fordi (1) det involverer sporing af ændringer i fluorescens af individuelle celler over tid, (2) fluorescenssignalet forsvinder intermitterende eller dukker op igen med neuronale reaktioner, og (3) neuronerne kan bevæge sig i alle retninger, specifikt ind og ud af et brændplan eller vises på flere planer4, 6. Manuel analyse er tidskrævende og bliver upraktisk, da længden af optagelser og antallet af neuroner stiger. Forskellige softwareprogrammer er blevet udviklet til at fremskynde processen med at analysere calciumbilleddannelse. Tidligere blev software designet i en begrænset eksperimentel sammenhæng, hvilket gjorde det vanskeligt for andre laboratorier at vedtage det. Nylige bestræbelser på at opfylde moderne standarder for softwaredeling har ført til udviklingen af flere værktøjer, der konsekvent kan analysere calciumbilleddata på tværs af forskellige grupper 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . De fleste af disse værktøjer kræver dog programmeringskendskab og / eller afhænger af kommerciel software. Mangel på programmeringsviden og softwarebetalingsmure afskrækker forskere fra at vedtage disse metoder. Desuden fokuserer mange af disse værktøjer på at korrigere x / y-bevægelsen, selvom bevægelse på z-aksen også skal eksplicit diagnosticeres og korrigeres6. Der er behov for et beregningsværktøj til at analysere 3D-calciumbilleddannelse, der fokuserer på neuroner, der udviser z-drift og vises på flere z-planer. Ideelt set bør dette værktøj bruge open source-software og ikke kræve programmeringskendskab for at give andre laboratorier mulighed for let at vedtage det.
Her udviklede vi et nyt ImageJ-plugin, TACI, til at analysere 3D-calciumbilleddata. Først omdøber softwaren om nødvendigt og organiserer 3D-calciumbilleddataene efter z-positioner. De interessante celler spores i hver z-position, og deres fluorescensintensiteter ekstraheres af TrackMate eller andre beregningsværktøjer. TACI anvendes derefter til at undersøge bevægelsen på z-aksen. Den identificerer den maksimale værdi af en z-stak og bruger den til at repræsentere en celles intensitet på det tilsvarende tidspunkt. Denne arbejdsgang er velegnet til at analysere 3D-calciumbilleddannelse med bevægelse i alle retninger og / eller med neuroner, der overlapper hinanden i lateral (x / y) retning, men vises i forskellige z-positioner. For at validere denne arbejdsgang blev 3D-calciumbilleddannelsesdatasæt fra fluelarvstermofølsomme neuroner og svampeneuroner i hjernen brugt. Bemærk, TACI er et open source ImageJ-plugin og kræver ingen programmeringskendskab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse udviklede et nyt ImageJ-plugin, TACI, og beskrev en arbejdsgang, der analyserede 3D-calciumbilleddannelse. Mange aktuelt tilgængelige værktøjer fokuserer på at korrigere x / y-bevægelsen, selvom bevægelse på z-aksen også skal diagnosticeres eksplicit eller korrigeres6. Under billedoptagelse i en levende organisme er bevægelse på z-aksen uundgåelig, selv når organismen er immobiliseret, og nogle stimuli, såsom temperaturændring, forårsager ofte betydelig z-drift. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
En Zeiss LSM 880 i Fralin Imaging Center blev brugt til at indsamle calciumbilleddata. Vi anerkender Dr. Michelle L Olsen og Yuhang Pan for deres hjælp med IMARIS softwaren. Vi anerkender Dr. Lenwood S. Heath for konstruktive kommentarer til manuskriptet og Steven Giavasis for kommentarer til GitHub README-filen. Dette arbejde blev støttet af NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) og NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) til L.N. Bidragyderne havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejdelse af manuskriptet.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
Referências
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
