Artigo de método
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) é um plugin ImageJ de código aberto para análise de imagem de cálcio 3D que examina o movimento no eixo z e identifica o valor máximo de cada z-stack para representar a intensidade de uma célula no ponto de tempo correspondente. Pode separar neurônios sobrepostos na direção lateral (x / y), mas em diferentes planos z.
A pesquisa em neurociência evoluiu para usar imagens complexas e ferramentas computacionais para extrair informações abrangentes de conjuntos de dados. A imagem de cálcio é uma técnica amplamente utilizada que requer software sofisticado para obter resultados confiáveis, mas muitos laboratórios lutam para adotar métodos computacionais ao atualizar protocolos para atender aos padrões modernos. As dificuldades surgem devido à falta de conhecimento de programação e paywalls para software. Além disso, as células de interesse exibem movimentos em todas as direções durante a imagem de cálcio. Muitas abordagens foram desenvolvidas para corrigir o movimento na direção lateral (x/y).
Este artigo descreve um fluxo de trabalho usando um novo plug-in ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), para examinar o movimento no eixo z em imagens de cálcio 3D. Este software identifica o valor máximo de fluorescência de todas as posições z em que um neurônio aparece e o usa para representar a intensidade do neurônio na posição t correspondente. Portanto, esta ferramenta pode separar neurônios sobrepostos na direção lateral (x / y), mas aparecendo em planos z distintos. Como um plugin ImageJ, o TACI é uma ferramenta computacional de código aberto e fácil de usar para análise de imagens de cálcio 3D. Validamos esse fluxo de trabalho usando neurônios termossensíveis de larvas de moscas que exibiam movimentos em todas as direções durante a flutuação da temperatura e um conjunto de dados de imagem de cálcio 3D adquirido do cérebro da mosca.
O nível de cálcio intracelular é um marcador preciso de excitabilidade neuronal. A imagem de cálcio mede as alterações no cálcio intracelular para entender a atividade neuronal1. Estudos em neurociência têm utilizado cada vez mais esse método devido ao desenvolvimento de técnicas para medir a concentração intracelular de cálcio, incluindo indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), como o GCaMP2,3, que podem ser expressos de forma não invasiva em conjuntos específicos de neurônios por meio de abordagens genéticas. Os menores custos de lasers e componentes do microscópio tam....
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1. Imagem de cálcio
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Fluxo de trabalho de análise de imagem de cálcio 3D
Neste estudo, desenvolvemos um novo plugin ImageJ, TACI, e descrevemos um fluxo de trabalho para rastrear a deriva z e analisar imagens de cálcio 3D que identificam as respostas de células individuais que aparecem em múltiplas posições z (Figura 1). Essa ferramenta tem quatro funções: RENOMEAR, ORGANIZAR, EXTRAIR e MESCLAR. Primeiro, se os nomes das imag.......
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Este estudo desenvolveu um novo plugin ImageJ, TACI, e descreveu um fluxo de trabalho analisando imagens de cálcio 3D. Muitas ferramentas atualmente disponíveis se concentram na correção do movimento x/y, embora o movimento no eixo z também precise ser explicitamente diagnosticado ou corrigido6. Durante a aquisição de imagens em um organismo vivo, o movimento no eixo z é inevitável mesmo quando o organismo está imobilizado, e alguns estímulos, como a mudança de temperatura, muitas vezes causam uma.......
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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Um Zeiss LSM 880 no Fralin Imaging Center foi utilizado para coletar os dados de imagem de cálcio. Agradecemos à Dra. Michelle L Olsen e Yuhang Pan por sua assistência com o software IMARIS. Agradecemos ao Dr. Lenwood S. Heath por comentários construtivos sobre o manuscrito e Steven Giavasis por comentários sobre o arquivo README do GitHub. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) e NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) para L.N. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulha de Enchimento Blunt | BD | 303129 | |
| Cloreto de cálcio di-hidratado | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Ingrediente alimentar para moscas |
| Dióxido de carbono | Airgas | UN1013 | Tamanho 200 Cilindro de aço de alta pressão |
| CO2 kit de borbulhador | Genesee | 59-180 | |
| LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | Um Axio Observer Z1 invertido, equipado com 5 lasers, 2 detectores PMT padrão, detectores GaAsP de 32 canais, um detector Airyscan, e Definite Foco.2. |
| Software DAQami | Computação de Medição | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Ingrediente alimentar para moscas |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Ingrediente para alimentos para moscas |
| Etanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Ingrediente alimentar para moscas |
| Linha para moscas: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | Um presente gentil | |
| Linha para moscas: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Linha para moscas: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | Um presente gentil | |
| Linha para moscas: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | Um presente gentil | |
| Linha de mosca: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| Regulador de latão forjado de uso geral | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Tubulação de Drosophila Verde | Genesee | 59-124 | |
| Composto de transferência de calor | MG Chemicals | 860-60G | |
| Dissipador de calor | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Redimensionar para 12,9 x 5,5 cm |
| Iluminador | AmScope | LED-6W | |
| Levedura seca inativa | Genesee | 62-108 | Incubadora de ingredientes alimentares para moscas |
| Pervical | DR-41VL | Ciclo claro: escuro: 12h:12h; temperatura: 25 & graus; C; umidade: 40-50% RH. | |
| Metil-4-hidroxibenzoato | Thermo Scientific | 126965000 | Alimento para moscas Vidro |
| cobertura micro | VWR& | nbsp; 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Lâminas de microscópio | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Esmalte | Kleancolor | ||
| Frascos estreitos de Drosophila | Genesee | 32-113RL | |
| Objetivo | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Módulo de resfriamento Peltier | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | Plugs de 30 x 30 mm |
| Circuito de Fonte de Alimentação | Genesee | CSI1802X Fonte de Alimentação de Bancada Linear de 10 volts DC 2.0 amp Fonte de Alimentação | |
| Série 4750, tamanho 2 | |||
| L-tartarato de sódio e potássio tetrahidratado | Thermo Scientific | 033241-36 | Ingrediente alimentar para moscas |
| Inserção de palco | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Microscópio Estéreo | Olympus | SZ61 | Qualquer microscópio estéreo funciona |
| Genesee | 59-123 | T-Fitting | |
| Measurement Computing | USB-2001-TC | ||
| Microssonda termopar | Physitemp | IT-24P | |
| Fase piezo amarela | Wienecke e Sinske | 432339-9000-000 | |
| ingrediente alimentar da mosca | de Genesee | 62-101 |
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