עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע עריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM כדי לבנות מודל מדויק של מחלת דגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e.
Abstract
טכנולוגיית CRISPR/Cas9 הגדילה את ערכם של דגי זברה למידול מחלות גנטיות אנושיות, חקר פתוגנזה של מחלות וסינון תרופות, אך מגבלות המוטיב הסמוך של פרוטוספייסר (PAM) מהוות מכשול עיקרי ליצירת מודלים מדויקים של בעלי חיים של הפרעות גנטיות אנושיות הנגרמות על ידי גרסאות של נוקלאוטידים בודדים (SNVs). עד כה, כמה גרסאות SpCas9 עם תאימות PAM רחבה הראו יעילות בדגי זברה. היישום של עורך בסיס אדנין בתיווך SpRY (ABE), zSpRY-ABE8e, ו-gRNA שעבר שינוי סינתטי בדגי זברה איפשר המרה יעילה של בסיס אדנין-גואנין ללא הגבלת PAM. מתואר כאן פרוטוקול לעריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM בדגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e. על ידי הזרקת תערובת של zSpRY-ABE8e mRNA ו-gRNA מהונדס באופן סינתטי לעוברים של דגי זברה, נבנה מודל מחלת דגי זברה עם מוטציה מדויקת המדמה אתר פתוגני של גורם ההתבגרות של הריבוזום TSR2 (tsr2). שיטה זו מספקת כלי רב ערך לביסוס מודלים מדויקים של מחלות לחקר מנגנוני מחלה וטיפולים.
Introduction
וריאנטים חד-נוקלאוטידים (SNVs) הגורמים למוטציות שגויות או שטויות הם המקור הנפוץ ביותר למוטציות בגנום האנושי1. כדי לקבוע אם SNV מסוים הוא פתוגני, ולשפוך אור על הפתוגנזה שלו, נדרשים מודלים מדויקים של בעלי חיים2. דגי זברה הם מודלים טובים למחלות אנושיות, המציגים רמה גבוהה של הומולוגיה פיזיולוגית וגנטית עם בני אדם, מחזור התפתחותי קצר ויכולת רבייה חזקה, המהווה יתרון למחקר במאפיינים ומנגנונים פתוגניים, כמו גם לבדיקת תרופות3.
מערכת CRISPR/Cas9 (ראשי תיבות של Clustered regular interspaced short palindromic repeats) מיושמת באופן נרחב בעריכת גנום של מינים שונים, כולל דגי זברה4. בעזרת הנחיית gRNA, מערכת CRISPR/Cas9 יכולה ליצור שברים דו-גדיליים של DNA (DSB) באתר המטרה, אשר לאחר מכן מאפשרים החלפה של בסיס יחיד באמצעות שילוב מחדש של אתר המטרה עם תבניות DNA של תורם באמצעות מסלול תיקון מכוון הומולוגיה (HDR). עם זאת, היעילות של שיטת החלפת בסיס זו נמוכה למדי מכיוון שתהליך תיקון הדנ”א התאי מתבצע בעיקר על ידי מסלול הצטרפות קצה לא הומולוגי (NHEJ), המלווה בדרך כלל במוטציות החדרה ומחיקה (indel)5. למרבה המזל, טכנולוגיית עריכה חד-בסיסית מבוססת CRISPR/Cas9 מקלה באופן משמעותי על בעיה זו באמצעות עורכי בסיס, המאפשרים עריכה יעילה יותר בבסיס יחיד מבלי לגרום ל-DSB. שני סוגים עיקריים של עורכי בסיס, עורכי בסיס אדנין (ABEs) ועורכי בסיס ציטוזין (CBEs), פותחו כדי ליישם עריכת החלפת בסיס עבור A· T עד G· C ו- C·G עד T· A, בהתאמה 6,7,8,9,10,11. ארבעת הסוגים האלה של תחליפי בסיס מכסים 30% מהגרסאות הפתוגניות האנושיות12. שני סוגי עורכי הבסיס, כולל PmCDA1, מערכת BE, CBE4max, ABE7.10 ו-ABE8e, דווחו כעובדים בדגי זברה, כאשר BE4max ו-ABE8e דווחו במיוחד כבעלי פעילות עריכה גבוהה 13,14,15,16,17,18,19.
חלבוני Cas9 ממינים שונים, כולל Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes ו- S. canis, יושמו בעריכת גנים של דגי זברה, כאשר Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) נמצא בשימוש הנרחב ביותר20,21,22,23. עם זאת, SpCas9 יכול לזהות רק אתרי מטרה עם מוטיב סמוך של פרוטוספייסר NGG (PAM), אשר מגביל את טווח העריכה שלו ויכול לגרום לכך שלא יימצא רצף מתאים ליד האתר הפתוגני המעניין24. כדי להרחיב את טווח היעד, מגוון גרסאות SpCas9 תוכננו לזהות PAMs שונים באמצעות אבולוציה מכוונת ועיצוב מונחה מבנה. עם זאת, גרסאות מעטות יעילות בבעלי חיים, במיוחד בדגי זברה, מה שמגביל את היישום של דגי זברה במחקר מחלות הקשורות ל- SNV25,26,27,28. לאחרונה, דווח על שתי גרסאות של SpCas9, SpG ו- SpRY, עם מגבלות PAM פחות מחמירות (NGN עבור SpG ו- NNN עבור SpRY עם העדפה גבוהה יותר ל- NRN מאשר NYN) כמציגות פעילות עריכה גבוהה בתאים ובצמחים אנושיים 29,30,31,32. לאחר מכן, דווח כי SpG ו- SpRY, כמו גם מספר עורכי הבסיס המתווכים שלהם, כגון CBEs בתיווך SpRY ו- ABEs בתיווך SpRY, עובדים גם בדגי זברה, אשר ישפרו את היישום של מודלים של דגי זברה במחקר המכניסטי וסינון תרופות של מחלות הקשורות ל- SNV 18,33,34,35. יתר על כן, i-Silence הוצע כאסטרטגיה יעילה ומדויקת לנוקאאוט גנטי באמצעות המרת קודון התחלה בתיווך ABE מ-ATG ל-GTG או ACG36. השילוב של אסטרטגיית i-Silence ועורך הבסיס בתיווך SpRY zSpRY-ABE8e מספק שיטה חדשה למידול מחלות18. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע עריכה גנטית באמצעות zSpRY-ABE8e בדגי זברה כדי לבנות מודל tsr2 (M1V) באמצעות אסטרטגיית i-Silence. יעילות העריכה והפנוטיפים המופיעים במודלים של דגי זברה הוערכו ונותחו.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את הבנייה של מודל מחלת דגי זברה באמצעות עורך הבסיס zSpRY-ABE8e. בהשוואה למסלול HDR המסורתי להחלפת בסיס, פרוטוקול זה יכול להשיג עריכת בסיס יעילה יותר ולהפחית את התרחשות האינדלים. במקביל, פרוטוקול זה כולל יישום אסטרטגיית הנוקאאוט הגנטי i-Silence שהוצעה לאחרונה בדגי זברה. יחד, zSpRY-ABE8e יש?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לברברה גרברס, PhD, מליוואן ביאנג’י (אדנז) על עריכת הטקסט באנגלית של טיוטה של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח של אזור המפתח של מחוז גואנגדונג (2019B030335001), תוכנית המו”פ הלאומית של סין (2019YFE0106700), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32070819, 31970782), ותוכנית קרן המחקר של מעבדת המפתח המחוזית של גואנגדונג לביולוגיה פתוגנית ואפידמיולוגיה לבעלי חיים כלכליים ימיים (PBEA2020YB05).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
Referências
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
