Generering av genetiskt modifierade Plasmodium berghei Sporozoites

Summary

Malaria överförs genom inokulering av sporozoitstadiet av Plasmodium av infekterade myggor. Transgent Plasmodium har gjort det möjligt för oss att förstå malarians biologi bättre och har bidragit direkt till utvecklingen av malariavaccin. Här beskriver vi en strömlinjeformad metodik för att generera transgena Plasmodium berghei-sporozoiter.

Abstract

Malaria är en dödlig sjukdom som orsakas av parasiten Plasmodium och överförs genom bett av honmyggor . Sporozoitstadiet av Plasmodium som deponeras av myggor i huden på ryggradsdjur genomgår en fas av obligatorisk utveckling i levern innan klinisk malaria inleds. Vi vet lite om biologin bakom Plasmodiums utveckling i levern; tillgång till sporozoitstadiet och förmågan att genetiskt modifiera sådana sporozoiter är viktiga verktyg för att studera arten av Plasmodium-infektion och det resulterande immunsvaret i levern. Här presenterar vi ett omfattande protokoll för generering av transgena Plasmodium berghei-sporozoiter. Vi genmodifierar P. berghei i blodstadiet och använder denna form för att infektera Anopheles-myggor när de tar en blodmåltid. Efter att de transgena parasiterna har utvecklats i myggorna isolerar vi parasitens sporozoitstadium från myggornas spottkörtlar för in vivo och in vitro-experiment . Vi demonstrerar protokollets giltighet genom att generera sporozoiter av en ny stam av P. berghei som uttrycker det gröna fluorescerande proteinet (GFP) subenhet 11 (GFP₁₁), och visar hur det kan användas för att undersöka biologin bakom levermalaria.

Introduction

Trots framsteg inom läkemedelsutveckling och forskning om förebyggande och behandling av malaria är den globala sjukdomsbördan av malaria fortfarande hög. Över en halv miljon människor dör av malaria varje år, och den högsta dödligheten bland barn som lever i malariaendemiska regioner,^{såsom Afrika söder} om Sahara1. Malaria orsakas av parasiten Plasmodium, som överförs till människor genom bett av honmyggor av hona som bär parasiten i sina spottkörtlar. Det infektiösa stadiet av Plasmodium – sporozoiterna – deponeras i huden hos ryggradsdjuren under en blodmåltid och färdas genom blodomloppet för att infektera leverceller, där de genomgår obligatorisk utveckling (som utgör pre-erytrocytisk malaria) innan de infekterar erytrocyterna. Infektionen i erytrocyterna initierar malarians blodstadium och är ansvarig för hela den sjuklighet och dödlighet som är förknippad^{med sjukdomen.}

Den obligatoriska karaktären hos den pre-erytrocytiska utvecklingen av Plasmodium har gjort det till ett attraktivt mål för profylaktiska vaccin- och läkemedelsutvecklingsinsatser⁴. En förutsättning för att studera biologin bakom pre-erytrocytisk malaria, samt utveckling av vacciner eller läkemedel som riktar sig mot leverstadiet, är tillgång till Plasmodium sporozoiter. Dessutom har vår förmåga att generera genetiskt modifierade Plasmodium sporozoiter varit avgörande för framgången för sådana forskningssträvanden 5,6,7,8,9. Transgena Plasmodium-linjer som uttrycker fluorescerande eller självlysande reporterproteiner har gjort det möjligt för oss att spåra deras utveckling in vivo och in vitro^10,11. Genetiskt försvagade parasiter (GAPs), som genereras genom radering av flera gener i Plasmodium, är också några av de mest lovande vaccinkandidaterna^12,13.

Malariamodeller från gnagare och icke-mänskliga primater har hjälpt oss att förstå mekanismerna för värd-parasitinteraktioner i mänsklig malaria på grund av likheterna i biologi och livscykel mellan Plasmodium-arter ¹⁴. Användningen av Plasmodium-arter som infekterar gnagare, men inte människor (t.ex. P. berghei) gör det möjligt att upprätthålla parasitens hela livscykel och generera infektiösa sporozoiter för att studera malaria i leverstadiet i en kontrollerad biosäkerhetsnivå 1-miljö. Det finns redan en mängd separata protokoll för generering av transgena Plasmodium-parasiter i blodstadiet¹⁵, infektion av myggor 16 och isolering av sporozoiter¹⁷. Här beskriver vi ett omfattande protokoll som kombinerar dessa metoder för att generera och isolera transgena P. berghei-sporozoiter, med hjälp av den nya transgena stammen PbGFP₁₁ som exempel. PbGFP 11 transporterar den 11:e β-strängen av det gröna fluorescerande proteinet (GFP), GFP₁₁, till den parasitofora vakuolen (PV) som genereras i värdhepatocyterna. PbGFP 11 används tillsammans med transgena hepatocyter (Hepa1-6-bakgrund) som uttrycker rester som utgör GFP 1-10-fragmentet (GFP 1-10) i cytoplasman (Hepa GFP _1-10-celler). PbGFP₁₁ rapporterar PV-lys i värdhepatocyterna genom självkomplementering och reformation av funktionell GFP och den gröna fluorescenssignalen¹⁸. Värt att notera är att GFP 11 kodas som en serie av sju tandemsekvenser i PbGFP₁₁ för att förstärka den resulterande fluorescenssignalen. Genom att färga PbGFP11-sporozoiter med det cytoplasmatiska färgämnet CellTrace Violet (CTV) kan vi spåra parasiterna. Lysen av sådana CTV-färgade intracellulära parasiter resulterar i sig i läckage av CTV in i värdcellens cytoplasma och färgning av värdcellen. Förutom att visualisera och särskilja lysen av Plasmodium PV och/eller parasiten i värdhepatocyter, kan detta system på ett tillförlitligt sätt användas för att studera de immunvägar som är ansvariga för någon av dessa processer, genom genetisk eller terapeutisk störning av de molekylära komponenterna i sådana vägar.

Protocol

All forskning som involverar ryggradsdjur i vårt laboratorium utfördes i enlighet med University of Georgias riktlinjer och protokoll för djuranvändning. 1. Generering av P. berghei-infekterade möss Initiera infektion i blodstadiet hos han- eller honmöss, 6-8 veckor gamla C57BL/6 (B6) med vildtypsparasiter av P. berghei. För att göra detta, överför kryokonserverat P. berghei-infekterat blod (2 x 105 infekterade röda blodkroppa…

Representative Results

Att bestämma frekvensen och utvecklingen av schizonter är avgörande för att säkerställa att tillräckligt många livskraftiga parasiter är i det optimala stadiet för transfektion. Omogna schizonter kan skiljas från fullt mogna schizonter genom närvaron av färre merozoiter som inte fyller hela det intracellulära utrymmet i RBC (Figur 1B). Det är viktigt att notera att när man gör blodutstryk från odlat blod kan infekterade röda blodkroppar brytas upp, vilket resulterar i obse…

Discussion

Vi har använt ovanstående protokoll i vårt laboratorium för att skapa flera linjer av transgena P. berghei-parasiter. Även om det är optimerat för P. berghei, har vi också framgångsrikt använt detta protokoll för att generera transgena P. yoelii sporozoiter. Efter att ha injicerat de transfekterade schizonterna i möss kan parasiter vanligtvis inte påvisas senare än 3 dpi i alla grupper, inklusive kontrollen utan plasmid. Selektionen påbörjas först när parasitemi har upptäckts…

Materials

30 G x 1/2" Syringe needle	Exel international	26437
Alsever's solution	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2	Lonza	VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	TCI America	T1420
Blood collection tubes	BD bioscience	365967	for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	For gradient centrifugation
Delta Vision II – Inverted microscope system	Olympus	IX-71
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D5879-500ml
Fetal bovine serum	GenClone	25-525
GFP11 plasmid	Kurup Lab	pSKspGFP11	Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum			Used for mosquito dissection media
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette	VWR	14673-043
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)	Cytivia	17-0891-02	Details in protocol
PL0017 Plasmid	BEI Resources	MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)	Sigma	46706	Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx microscopy software	Applied Precision	v6.1.3