在这里,我们提出了一种在小型猪模型中软硬膜下电极阵列的长期性能和安全性评估方法,描述了手术方法和工具、术后磁共振成像、听觉皮层的电生理学、植入物的电化学特性和死后免疫化学。
神经损伤和疾病可以使用皮质电图 (ECoG) 阵列进行诊断或治疗。在耐药性癫痫中,这些有助于划定要切除的癫痫区域。在脑机接口等长期应用中,这些皮质外层电极用于记录大脑的运动意图,以控制瘫痪患者的机器人肢体。然而,目前僵硬的电极网格并不能满足高分辨率大脑记录和长期生物整合的需求。最近,人们提出了适形电极阵列,以实现长期的植入物稳定性和高性能。然而,需要对这些新的植入技术进行临床前研究,以验证其转化为人类患者的长期功能和安全性。在这种情况下,猪模型因其器官尺寸大且易于动物处理而经常被用于开发医疗设备。然而,文献中只描述了少数大脑应用,主要是由于手术限制和植入系统在活体动物上的集成。
在这里,我们报告了长期植入(6个月)的方法和在minipig模型中评估软ECoG阵列的方法。该研究首先介绍了植入系统,该系统由一个软微加工电极阵列组成,该电极阵列集成了与磁共振成像 (MRI) 兼容的聚合物透皮端口,该端口包含用于电生理记录的仪器连接器。然后,该研究描述了从硬膜下植入到动物恢复的外科手术。我们以听觉皮层为例,通过声刺激诱导诱发电位。我们最后描述了一个数据采集序列,包括整个大脑的 MRI、植入物电化学表征、术中和自由移动的电生理学以及提取的大脑的免疫组织化学染色。
该模型可用于研究皮质假体新设计的安全性和功能;强制性临床前研究,以设想转化为人类患者。
神经损伤和疾病可以使用皮质电图 (ECoG) 阵列进行诊断或治疗。这些电极网格被植入大脑表面,并允许记录或刺激人类皮层1。例如,在耐药性癫痫的情况下,它们有助于描绘癫痫区域以切除2。在脑机接口等长期应用中,这些皮质外层电极用于记录大脑的运动意图,以控制瘫痪患者的机器人肢体3。然而,目前的电极网格由嵌入刚性聚合物基材中的刚性金属块制成,不能满足高分辨率大脑记录和长期硬膜下生物整合(>30 天)的需求。相反,它们会产生局部组织反应,导致植入装置的纤维化封装,导致性能随着时间的推移而变差。最近,使用通过微纳加工技术制造的薄聚合物基板的柔性或可拉伸电极阵列已被提出,通过限制组织反应在长期植入中实现高性能4,5。然而,需要对这些新的植入技术进行临床前研究,以验证其长期功能和安全性,以便可以设想转化为人类患者。在这种情况下,小型猪和猪模型通常用于其他医疗环境(例如,心血管、骨骼或胃系统)的设备开发,因为它们的器官尺寸大且易于动物处理6,7,8。然而,文献中只描述了少数针对大脑的神经生理学应用,主要是由于手术方法的局限性和植入系统在活体动物上的集成9,10,11,12。这些通常与活体动物的慢性植入不相容,因为它们需要开发复杂的硬件,例如可植入的嵌入式电子设备。此外,他们没有研究植入系统对目标组织的影响,这对于转化研究中的生物安全方面至关重要。猪模型在皮质结构、颅骨和皮肤厚度方面接近人体解剖结构13。此外,他们学习行为任务的能力使他们成为研究功能康复策略或感觉知觉的有力模型14.
将新技术和疗法转化为人类需要按照主管医疗当局的要求对安全性和有效性进行评估。这些通常在技术文件和规范15 中描述,但它们只需要通过这些测试,而不调查设备植入的实际效果或在安全研究的同时收集其他有用数据。为了对大脑进行完整的生物安全性和性能研究,我们在这里展示了脑成像数据、电生理测量、植入电极电化学特性评估以及猪模型中死后组织学的纵向和系统收集。为了实现这一点,需要考虑几个方面,以便创建一个完整的实验模型:(i)用于设备植入的微创手术通路以及用于连接到电极的机械稳定的透皮端口,(ii)强大的电生理记录范式,在麻醉和自由移动条件下作为植入电极的性能输出, (iii) 不同时间点的 活体 成像(计算机断层扫描 [CT] 和/或磁共振成像 [MRI]),以跟踪大脑和植入物的演变,以及植入系统与成像设备的兼容性,以及 (iv) 提取大脑进行组织学分析的组织制备管道。
在这里,我们报告了长期植入(6个月)的方法和在minipig模型中评估软ECoG阵列的方法(如图1所示)。软电极阵列在我们之前的报告中介绍过,由嵌入弹性金薄膜的薄硅胶膜制成,用作电轨道16,17。与组织的接触是通过嵌入有机硅基质中的铂纳米颗粒的混合物来实现的,以获得与脑组织18的柔软而有效的电化学界面。植入物通过一根柔性电缆通过硬膜下穿过颅骨和皮肤连接到动物头部的透皮端口,该端口将连接器装在动物头部。植入物的大小和形状可以根据目标和研究的需要进行定制。本研究中的电流电极条反映了临床条的实际尺寸。使用相同的方法使用临床可用的硬膜下条带和网格作为对照。聚合物 MRI 兼容透皮端口使用脚踏板系统放置在颅骨上,该系统将其牢固地固定在颅骨上。在这里,我们详细描述了从双半球硬膜下植入到动物恢复的外科手术。我们以听觉皮层为例,在麻醉和自由移动的条件下,通过声刺激诱导诱发电位。在不同的时间点,在麻醉下通过MRI(或临床电极的CT)对动物的大脑进行成像,并测量电极的电化学性质。电极表征方法用于跟踪植入物和电极-组织界面的演变(详见Schiavone等人19)。其中包括用于探测电极接触刺激能力的计时电流法、可以指示电极电阻和电容成分演变的电化学阻抗谱 (EIS) 以及用于探测密封封装故障的通道间电阻测量。最后,我们开发了一种组织提取管道,用于在安乐死后灌注大脑,在电极就位的情况下将其取出,对其进行切片,并使用不同的炎症标志物进行组织学分析。总体而言,这种方法将允许临床前研究通过强大的多模态数据收集,用于未来在大脑上对新技术和疗法的临床转化。
我们在这里报告了一种软ECoG阵列的长期植入和评估方法。在这项研究中,我们设计了一种一致的微创手术方法,用于在颞叶(此处针对听觉皮层)上双侧植入功能性电极网格。我们首先通过在研究过程中(6个月)成功记录诱发电位并跟踪电极的电化学特性来评估栅极的功能(见 图6)。其次,我们通过使用 MRI 和建立完全兼容 MRI 的系统来评估网格的生物 安全性,并通过 设计组织收集和免疫染色方案来评估死后。
为了尽量减少侵入性,我们优化了开颅手术窗口的大小。为了到达位于颞叶上的听觉皮层并避免切除颞肌,我们开发了一种将植入物滑到硬脑膜下的技术。这种技术可以大大减少暴露的大脑表面,并且仍然可以到达远处的目标。虽然这种类型的植入可能看起来是盲目的,但在术中平面 X 射线中可见的设备上实施不透射线的标记可以验证定位,并确保阵列不会折叠在硬脑膜下。硬膜下滑动已被证明在我们进行的大多数重复中是安全的。此外,狭缝方法中的硬脑膜切开术可最大限度地减少开颅手术期间的脑膨出,并促进植入物周围的闭合,而无需额外的材料,例如人造硬脑膜,这可能会偏向炎症反应。最后,这种手术方法的优势在于它能够转移到不同的皮质区域。使用坐标、开颅手术位置和设备尺寸(都可以调整)使这种方法能够针对大部分皮层区域。
这里介绍的手术方法,以及功能评估和随时间推移的生物整合研究,不限于本报告中使用的软电极技术。其他正在开发的用于人类翻译的硬膜下电极可以使用相同的协议进行评估。这种方法的优势在于,大多数部件(例如电缆和底座)都是模块化的、可个性化的,并且可以适应被测的特定设备。此外,皮质内或深穿透探针也可以代替硬膜下电极或与硬膜下电极结合使用,因为这只需要调整开颅手术和硬脑膜切开术的几何形状。然后可以将长期结果与临床结果进行比较,就像我们在这里所做的那样。
所提出的方法的主要局限性之一是迷你猪中存在颅骨窦,这些颅窦在第一年的过程中发育12.在这方面,需要考虑的重要方面包括植入年龄和动物的大小。在成人颅骨中进行开颅手术会破坏鼻窦的完整性,并导致慢性环境中发生严重感染的高风险。这种鼻窦在术前的平面 X 线和 CT 扫描中可见。另一方面,在太小的动物中过早进行慢性植入,在颅骨经历大规模生长和重塑时也不是最佳选择。我们假设手术后的这些“颅骨运动”可能会导致植入物移动和折叠,这最终对实验不利。我们在这里发现,哥廷根迷你猪,在植入时大约 5-6 个月大(和 8 公斤),应该给出最好的结果。
为了评估植入的 ECoG 在电生理记录中的性能,我们建立了一个用于听觉诱发电位 (AEP) 记录的快速方案,可用于自由移动的动物和镇静状态。它包括在几分钟内呈现特定频率的一系列声学音爆。这种协议的优点是,它可以通过减少探测的频率数量来调整到可用的记录长度。在麻醉下记录皮质信号时的一个挑战是,在分析和比较数据时,应考虑动物的意识水平。
灌注方案通过观察提取的大脑的质量随着时间的推移进行调整。事实上,我们发现只对颈动脉进行导管插入术更容易,而不是对颈静脉进行导管插入术。最初,文献提出了将颈静脉导管引流以排出废物的方法20。实际上,这限制了大脑的流动,并导致血液提取和灌注的整体质量较差。通过切割颈静脉并将液体留在动物所在的大容器中逸出,灌注效率提高。
我们开发了一种强大的组织制备方法,可与常规用于炎症追踪的抗体配合使用。出于实际原因,我们将两个半球分开,因为猪的大脑有一半适合标准显微镜载玻片,因此与组织学实验室中的大多数成像设备兼容。通过将大脑切成块,可以直接进入感兴趣的区域,而无需进一步切割整个大脑或修剪组织的广泛部分。40 μm 的脑切片可以汇集在标准孔板中并以自由浮动的方式染色,而不会因其他物种的免疫染色而发生重大方案变化。也可以通过使用例如CLARITY方法21来设想全脑免疫染色。
总体而言,该协议涵盖个性化植入物设计到植入、功能随访和生物安全评估,是稳健且一致的。我们在这里证明了它研究听觉系统的可行性,但它可以转位来测试其他生理功能。此外,我们方法的优势在于它不仅限于迷你猪,而是可以完全转座到其他物种,如绵羊、山羊或非人类灵长类动物。在一定程度上,它也可以很容易地适应老鼠。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢Bertarelli基金会和SNSF Sinergia赠款CRSII5_183519的财政支持。作者还要感谢洛桑联邦理工学院(EPFL)的Katia Galan在制定组织学染色方案方面的帮助,感谢日内瓦Wyss生物与神经工程中心神经微系统平台的工作人员对制造过程的帮助,感谢日内瓦大学(UNIGE)大学医学中心(CMU)动物平台的工作人员进行动物护理, 迷你猪的手术协助和术后管理(John Diaper、Xavier Belin、Fabienne Fontao 和 Walid Habre)、日内瓦大学生物医学成像中心 (CIBM) 的团队成员(Julien Songeon、François Lazeyras 和 Rares Salomir)、日内瓦大学医院病理科的工作人员 (HUG) (Sami Schranz、Francesca Versili、 鲁本·索托(Ruben Soto)和科拉琳·艾格(Coraline Egger)以及格勒诺布尔斯阿尔卑斯大学的布莱斯·伊弗特(Blaise Yvert)对慢性小型猪实验的投入和交流。作者要感谢 Neurosoft Bioelectronics SA 员工的帮助,感谢他们在制造过程中的帮助以及他们在迷你猪实验中的帮助(Benoit Huguet 和 Margaux Roulet)。
Bone drill | BBraun | Elan 4 with GA861 handpiece | |
Bone drill bit | BBraun | Neurocutter GP204R | |
Bonewax | Ethicon | W31G | |
Catheter | Venisystems | Abbocath 14G | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
Cryostat | Leica | CM1950 | |
Gelfoam | Pfizer | Gelfoam | |
Insert speakers | Etymotic | Etymotic ER2 insert Earphones | |
Multimeter | Fluke | Fluke 1700 | |
Oscilloscope | Tektronix | MDO3014 Mixed Domain Oscilloscope | |
Perfusion pump | Shenzen | LabS3/UD15 | |
Potentiostat | Gamry Instruments | Reference 600 | |
Primary Antibody Anti-GFAP | Thermofischer | Anti-GFAP, Rat, # 13-0300 | |
Primary Antibody Anti-Iba1 | Fujifilm | Anti Iba1, Rabbit, 019-19741 | |
Primary Antibody Anti-NeuN | SigmaAldrich | Anti-NeuN, GuineaPig, ABN90 | |
Pulse Generator | AM Systems | Model 2100 Isolated Pulse Stimulator | |
Recording headstage | Multichannel systems | W2100-HS32 | |
Recording system | Multichannel systems | W2100 | |
Screwdriver | Medtronic | Handle: 001201, Shaft: 8001205 | |
Secondary Antibody 488 | Thermofischer | Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488, # A-11006 | |
Secondary Antibody 555 | Thermofischer | Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555, # A-21435 | |
Secondary Antibody 647 | Thermofischer | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, # A-21245 | |
Slide Scanner | Olympus | VS120 | |
Snapfrost | Excilone | Excilone Snapfrost | |
Stab knife | Fine Science Tools | 10316-14 | |
Suture wire dermal | Ethicon | Vicryl 2-0 | |
Suture wire dura mater | Ethicon | Mersilk 5-0 | |
Suture wire for catheter | Ethicon | Vycril 3-0 without needle | |
Suture wire for lifting dura | Ethicon | Prolene 6-0 with BV-1 needle | |
Suture wire subcutaneous | Ethicon | Vicryl 4-0 | |
Titanium bridge | Medtronic | TiMesh 015-2001-4 | Cut out the required size |
Titanium screws | Medtronic | 9001635, 9001640 | |
X-ray system | GE | GE OEC 9800 Plus C-Arm |