Analisi della calcificazione vascolare extracellulare vescicolo-mediata mediante modelli in vitro e in vivo

Summary

Questo articolo presenta la metodologia per ottenere e valutare la calcificazione vascolare isolando le aorte murine seguita dall’estrazione di vescicole extracellulari calcificate per osservare il potenziale di mineralizzazione.

Abstract

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte nel mondo e la calcificazione vascolare è il predittore più significativo di eventi cardiovascolari; Tuttavia, attualmente non ci sono trattamenti o opzioni terapeutiche per la calcificazione vascolare. La calcificazione inizia all’interno di vescicole extracellulari specializzate (EV), che fungono da focolai nucleanti aggregando ioni calcio e fosfato. Questo protocollo descrive i metodi per ottenere e valutare la calcificazione nelle aorte murine e analizzare le EV estratte associate. In primo luogo, la dissezione grossolana del topo viene eseguita per raccogliere tutti gli organi rilevanti, come i reni, il fegato e i polmoni. Quindi, l’aorta murina viene isolata e asportata dalla radice aortica all’arteria femorale. Due o tre aorte vengono quindi raggruppate e incubate in una soluzione digestiva prima di essere sottoposte a ultracentrifugazione per isolare gli EV di interesse. Successivamente, il potenziale di mineralizzazione degli EV viene determinato attraverso l’incubazione in una soluzione ad alto contenuto di fosfato e misurando l’assorbanza della luce a una lunghezza d’onda di 340 nm. Infine, gli idrogel di collagene vengono utilizzati per osservare la formazione e la maturazione dei minerali calcificati prodotti dagli EV in vitro.

Introduction

La calcificazione è il predittore più significativo della mortalità e della morbilità delle malattie cardiovascolari¹. La calcificazione altera la meccanica della parete arteriosa a causa dell’accumulo di minerali di calcio e fosfato². Nell’aterosclerosi, la calcificazione può esacerbare lo stress locale e provocare la rottura della placca, che è la principale causa di attacchi di cuore. La calcificazione mediale, spesso derivante da malattia renale cronica, è più diffusa e porta a un significativo irrigidimento arterioso, disfunzione e sovraccarico cardiaco ^2,3. Attualmente, non ci sono opzioni terapeutiche per il trattamento o la prevenzione della calcificazione vascolare.

Le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) adottano un fenotipo simile agli osteoblasti e rilasciano vescicole extracellulari calcificanti (EV) che nucleano i minerali nascenti, guidando così la calcificazione ^4,5,6. Questo processo assomiglia alla mineralizzazione fisiologica degli osteoblasti nell’osso⁷. Sebbene l’endpoint della mineralizzazione sia simile nella parete vascolare e nella matrice ossea, i meccanismi con cui hanno origine le EV calcificanti differiscono nei due tessuti⁸. Esistono molti tipi di modelli utilizzati per studiare la calcificazione vascolare. In vitro, i modelli di coltura cellulare imitano la transizione osteogenica dei VSMC e la successiva formazione di minerali con mezzi specializzati.

Quando si studia la calcificazione in vivo, il modello utilizzato dipende dal tipo di calcificazione studiata. I modelli murini iperlipidemici sono spesso usati per studiare la calcificazione aterosclerotica, che appare più focale all’interno delle placche ricche di lipidi⁹. Al contrario, la calcificazione mediale è più diffusa in tutta la vascolarizzazione ed è spesso studiata utilizzando modelli di malattia renale cronica che impiegano un regime dietetico ricco di adenina per indurre insufficienza renale o tecniche chirurgiche per rimuovere porzioni significative dei reni^10,11. I modelli aggressivi di calcificazione vascolare hanno utilizzato una combinazione di modelli di malattia renale iperlipidemica e cronica¹². Questo protocollo fornisce un metodo per valutare la calcificazione vascolare nelle aorte murine sia per la calcificazione mediale che aterosclerotica, estraendo EV dalla parete aortica e osservando il potenziale di mineralizzazione nelle EV ottenute da modelli di coltura cellulare in vitro. Studi futuri possono utilizzare queste procedure nelle analisi meccanicistiche della calcificazione vascolare e per valutare potenziali interventi terapeutici.

Protocol

Il lavoro in vivo è stato approvato e supervisionato dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Florida International University e conforme alle attuali linee guida del National Institutes of Health (NIH). Per questo protocollo, la procedura non differisce a seconda del ceppo, del peso, dell’età e del sesso del topo. Il tipo di calcificazione studiata, le diete e i trattamenti possono alterare la durata dello studio e il peso del topo utilizzato e possono dipendere da un ceppo specifico…

Representative Results

Una volta estratte le aorte, l’imaging utilizzando uno scanner ottico nel vicino infrarosso mostra una rappresentazione visiva dell’aorta e della calcificazione vascolare (Figura 1). I valori di intensità dei pixel all’interno dell’immagine fluorescente scansionata rappresentano la distribuzione della calcificazione e vengono mostrati qui utilizzando una mappa di calore colorata. I metodi di quantificazione includono l’identificazione di una soglia positiva e la segnalazione dell’area perce…

Discussion

Quando si esegue il protocollo, è importante notare i passaggi critici per ottenere risultati positivi. Durante l’isolamento dell’aorta murina, è fondamentale che la perfusione venga eseguita correttamente. Quando si inietta il PBS, bisogna fare attenzione a non perforare il ventricolo destro. Ciò causerebbe la fuoriuscita del liquido direttamente dal ventricolo e non riuscirebbe a circolare attraverso i polmoni, lasciando sangue all’interno dell’aorta. Una volta che la perfusione è stata condotta correttamente e la …

Materials

8-well chambered coverglass	Thermo Scientific	155409PK
10 mL Syringe	BD	302995
20 G 1 inch Needle	BD	305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail	Corning	354249
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-8254
Dissection Dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Dissection Pan and Wax	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)	Roboz Surgical Instrument	RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor	Thermo Scientific	A32963
Potassium Chloride	Fischer Chemical	P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer	G Biosciences	786-489
Sodium Chloride	Fischer Chemical	BP358
Sodium Hydroxide	Thermo Scientific	A4782602
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751
Sucrose	Sigma	S7903
Synergy HTX Multimode Reader	Agilent
Tissue culture plate, 96-well	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride	Fischer Chemical	BP153