Questo articolo presenta la metodologia per ottenere e valutare la calcificazione vascolare isolando le aorte murine seguita dall’estrazione di vescicole extracellulari calcificate per osservare il potenziale di mineralizzazione.
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte nel mondo e la calcificazione vascolare è il predittore più significativo di eventi cardiovascolari; Tuttavia, attualmente non ci sono trattamenti o opzioni terapeutiche per la calcificazione vascolare. La calcificazione inizia all’interno di vescicole extracellulari specializzate (EV), che fungono da focolai nucleanti aggregando ioni calcio e fosfato. Questo protocollo descrive i metodi per ottenere e valutare la calcificazione nelle aorte murine e analizzare le EV estratte associate. In primo luogo, la dissezione grossolana del topo viene eseguita per raccogliere tutti gli organi rilevanti, come i reni, il fegato e i polmoni. Quindi, l’aorta murina viene isolata e asportata dalla radice aortica all’arteria femorale. Due o tre aorte vengono quindi raggruppate e incubate in una soluzione digestiva prima di essere sottoposte a ultracentrifugazione per isolare gli EV di interesse. Successivamente, il potenziale di mineralizzazione degli EV viene determinato attraverso l’incubazione in una soluzione ad alto contenuto di fosfato e misurando l’assorbanza della luce a una lunghezza d’onda di 340 nm. Infine, gli idrogel di collagene vengono utilizzati per osservare la formazione e la maturazione dei minerali calcificati prodotti dagli EV in vitro.
La calcificazione è il predittore più significativo della mortalità e della morbilità delle malattie cardiovascolari1. La calcificazione altera la meccanica della parete arteriosa a causa dell’accumulo di minerali di calcio e fosfato2. Nell’aterosclerosi, la calcificazione può esacerbare lo stress locale e provocare la rottura della placca, che è la principale causa di attacchi di cuore. La calcificazione mediale, spesso derivante da malattia renale cronica, è più diffusa e porta a un significativo irrigidimento arterioso, disfunzione e sovraccarico cardiaco 2,3. Attualmente, non ci sono opzioni terapeutiche per il trattamento o la prevenzione della calcificazione vascolare.
Le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) adottano un fenotipo simile agli osteoblasti e rilasciano vescicole extracellulari calcificanti (EV) che nucleano i minerali nascenti, guidando così la calcificazione 4,5,6. Questo processo assomiglia alla mineralizzazione fisiologica degli osteoblasti nell’osso7. Sebbene l’endpoint della mineralizzazione sia simile nella parete vascolare e nella matrice ossea, i meccanismi con cui hanno origine le EV calcificanti differiscono nei due tessuti8. Esistono molti tipi di modelli utilizzati per studiare la calcificazione vascolare. In vitro, i modelli di coltura cellulare imitano la transizione osteogenica dei VSMC e la successiva formazione di minerali con mezzi specializzati.
Quando si studia la calcificazione in vivo, il modello utilizzato dipende dal tipo di calcificazione studiata. I modelli murini iperlipidemici sono spesso usati per studiare la calcificazione aterosclerotica, che appare più focale all’interno delle placche ricche di lipidi9. Al contrario, la calcificazione mediale è più diffusa in tutta la vascolarizzazione ed è spesso studiata utilizzando modelli di malattia renale cronica che impiegano un regime dietetico ricco di adenina per indurre insufficienza renale o tecniche chirurgiche per rimuovere porzioni significative dei reni10,11. I modelli aggressivi di calcificazione vascolare hanno utilizzato una combinazione di modelli di malattia renale iperlipidemica e cronica12. Questo protocollo fornisce un metodo per valutare la calcificazione vascolare nelle aorte murine sia per la calcificazione mediale che aterosclerotica, estraendo EV dalla parete aortica e osservando il potenziale di mineralizzazione nelle EV ottenute da modelli di coltura cellulare in vitro. Studi futuri possono utilizzare queste procedure nelle analisi meccanicistiche della calcificazione vascolare e per valutare potenziali interventi terapeutici.
Quando si esegue il protocollo, è importante notare i passaggi critici per ottenere risultati positivi. Durante l’isolamento dell’aorta murina, è fondamentale che la perfusione venga eseguita correttamente. Quando si inietta il PBS, bisogna fare attenzione a non perforare il ventricolo destro. Ciò causerebbe la fuoriuscita del liquido direttamente dal ventricolo e non riuscirebbe a circolare attraverso i polmoni, lasciando sangue all’interno dell’aorta. Una volta che la perfusione è stata condotta correttamente e la …
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Heart, Lung, and Blood Institute del National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 e 5 T32GM132054-04) e della Florida Heart Research Foundation. Vorremmo ringraziare Kassandra Gomez per il suo aiuto nella sintesi e nell’imaging degli idrogel.
8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
10 mL Syringe | BD | 302995 | |
20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |